单细胞与空间转录组学¶

单细胞转录组将组织平均拆成细胞尺度的稀疏表达向量，空间转录组再把核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）测量连接到组织位置。两者共享表达计数的基础，又新增了条形码（barcode）、唯一分子标识符（unique molecular identifier，UMI）、细胞或捕获位置、图像与坐标等数据对象，中心问题也转向细胞类型、连续状态、发育轨迹、组织域和细胞邻域。群体样本的 qPCR、芯片、群体 RNA 测序（bulk RNA-seq）、转录本结构和差异表达见转录组测量与 RNA-seq 分析。

单细胞和单核转录组¶

单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）将组织平均拆成许多细胞的稀疏表达向量。基于孔板（plate-based）的全长方法能在较少细胞中获得较丰富的转录本结构，基于液滴（droplet-based）的 3′／5′ 标签方法用微液滴和分子条形码并行处理成千上万细胞。液滴测序（Drop-seq）的关键设计是让同一微珠（bead）上的引物共享细胞条形码，而每条引物携带随机 UMI；读段因而能先归属细胞，再按基因和 UMI 近似计数原始分子。¹ 细胞条形码、样本索引（sample index）和 UMI 分别标识细胞、文库样本和原始分子。

单核 RNA 测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）从细胞核制备 RNA，适合冻存组织、难解离组织和大型脆弱细胞，也可减少完整细胞解离造成的选择性丢失。它更偏向核内、未剪接和内含子信号，胞质成熟信使 RNA（messenger RNA，mRNA）与局部转录本较少；与全细胞数据整合时，这种区室差异属于测定效应（assay effect）。解离本身会诱发即时早期和应激基因，并选择更易释放或更耐受的细胞。细胞图谱中的缺失类群可能在生物样本中稀少，也可能在取材前已经丢失。

条形码、UMI 与稀疏计数矩阵¶

一枚液滴条形码可能对应空液滴、一个完整细胞或多个细胞。空液滴可捕获环境 RNA，两个或多个细胞同入一滴形成双细胞／多细胞（doublet／multiplet），受损细胞释放的 RNA 会进入其他液滴。条形码排序曲线（barcode rank）、总 UMI、检测基因数、线粒体／核糖体比例和空液滴模型（empty-droplet model）可帮助区分细胞与背景；物种混合、基因型或抗体标签能提供更直接的双细胞证据。环境 RNA 校正（ambient RNA correction）是带模型的估计，校正后的低计数仍需结合基因特异性和细胞类型背景解释。

UMI 把共享细胞条形码、基因和近似 UMI 序列的读段合并，降低聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增造成的重复计数。UMI 序列空间有限，会发生碰撞（collision）；测序错误又可把一个分子拆成多个 UMI，因此去重复（deduplication）需要距离和丰度规则。多数液滴数据的基因—细胞矩阵记录“捕获并识别到的分子数”，捕获效率通常远低于细胞内真实总数。零值可能表示未表达，也可能表示分子未被捕获；稀疏性是抽样、文库深度和细胞状态共同结果。

质量过滤应在样本和细胞类型语境中进行。线粒体比例高常提示膜受损或濒死，也可能是某些高代谢细胞的真实特征；总 UMI 很高可能来自双细胞或大细胞；统一的总 RNA 下限又容易优先删除静息细胞。先按每个样本检查分布，再结合标志物（marker）、双细胞评分（doublet score）、组织知识和敏感性分析设置阈值，能减少质量控制本身改变细胞组成。

归一化、特征选择与降维¶

常见归一化先按每细胞总 UMI 缩放并进行对数变换（log transformation），或以计数模型（count model）同时估计测序深度和技术变异。缩放后的值便于距离、可视化和标志物探索，原始计数仍应保留给需要计数似然的模型。细胞总 RNA 在细胞周期、激活和体积变化中可能真实改变；把每个细胞都强制成相同总量会把这种变化折叠进相对组成。外源参照和成像分子计数在需要绝对量时更有价值。

高变基因（highly variable gene）把细胞间变异超过均值—方差背景的基因用于构建低维空间，减少管家基因与抽样噪声对距离的支配。主成分分析（principal component analysis，PCA）给出线性轴，扩散映射（diffusion map）强调局部连续结构，非线性的 t 分布随机邻域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）和统一流形近似与投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）常把高维邻域投影到二维。二维图会扭曲全局距离、簇面积和密度；不同参数、随机种子和预处理可改变岛屿形态。UMAP 上相邻表示模型中的候选相似，全局图距不直接表示发育时间或组织距离。

细胞周期、线粒体程序和应激程序可以解释主要变化。回归这些协变量（covariate）有时有助于观察另一条轴，有时却会删除与研究过程真实耦联的信号。是否校正应由问题决定，并比较校正前后的标志物、样本混合和已知连续过程；回归结果描述去除相应统计关联后的表示，变异的技术或生物来源仍需独立证据判断。

聚类与细胞注释¶

常见流程在降维空间建立 k 近邻图（k-nearest-neighbor graph，KNN graph），再以社区检测（community detection）划分细胞。簇数量由邻居数、分辨率、特征选择、样本构成和随机性共同决定；连续分化或激活过程也会被算法切成离散段。簇首先是当前数据和参数下的计算分组，天然细胞类型还需生物学注释。稳定性可通过重抽样、不同参数、独立样本和标志物一致性评估。

注释需要把多个正、负标志物、转录程序、组织位置、形态与已知生理功能结合。单个标志物可能在激活、损伤或发育阶段跨类群表达；低捕获又会造成标志物脱落（dropout）。参考图谱（reference atlas）的标签转移（label transfer）能提高一致性，但参考缺少的新状态可能被分到最相近类别，物种、年龄、组织区域和平台差异也会误导映射。最好同时报告细胞类型层级、注释证据与置信度，对混合或未知群保留较宽名称。

差异丰度问题比较各样本中某类细胞的比例，差异状态问题比较同一类细胞在条件间的表达。二者都以个体或独立样本为重复；来自同一个体的细胞共享技术和生物变异，把它们作为独立重复会产生伪重复和过多假阳性。按“样本 × 细胞类型”汇总原始计数形成伪批量样本（pseudobulk），再用 bulk 计数模型分析，或使用显式层级／混合模型，能够保留实验单位。单细胞差异分析的系统比较显示，丢弃生物学重复信息是假发现（false discovery）的重要来源。²

多批次整合与参考映射¶

整合算法寻找数据集间的互为近邻（mutual neighbor）、共享潜在因子（shared latent factor）或生成模型表示，使相同类型在低维空间对齐。它适合缓解平台、建库日和供体造成的非生物偏移，也可能把条件特异状态压平，或把共享应激程序的不同细胞错误连接。整合空间可用于可视化、聚类和标签转移；条件差异检验通常应回到保留样本和原始计数结构的数据，并在模型中处理批次（batch）。

整合评价需要同时检查批次混合和生物结构保留：已知同类细胞应跨批次邻近，已知不同谱系仍需分开，稀有类型应保持可辨认，条件特异群也需保留。标志物保真、局部邻域（local neighborhood）、样本混合、未参与训练的验证标签和未整合结果共同提供证据。批次与条件（condition）完全重合时，数据无法识别两者各自的效应，实验设计阶段需要避免这种混杂。

轨迹、伪时间与 RNA 速率¶

轨迹推断（trajectory inference）在表达空间中连接相似细胞，并以某个根节点（root）为起点给出伪时间（pseudotime）。它适合描述样本中捕获到的连续状态和候选分支，要求过程中的中间状态被充分取样。细胞周期、应激、不同谱系收敛表达和缺失中间状态都可形成误导路径；根节点和分支数还常由研究者或算法先验决定。伪时间是静态细胞集合的相似性排序，真实经过时间和亲子谱系需要时间序列或谱系追踪测量。

RNA 速率（RNA velocity）利用未剪接与已剪接 RNA 的比例，在转录、剪接和降解模型下估计局部表达变化方向。³ 稳态模型（steady-state model）或动力学模型（dynamical model）的参数、基因选择、内含子注释、诱导／抑制动力学和测序深度都会改变箭头；循环、瞬时响应和多稳态系统尤其需要谨慎。时间序列、脉冲标记（pulse labeling）、遗传条形码、克隆追踪和活细胞成像可直接约束方向与谱系。轨迹和 RNA 速率用于提出并排序发育假说，谱系追踪（lineage tracing）则直接检验细胞后代关系。

空间转录组的数据模型¶

解离单细胞数据保留每个细胞的表达，但移除了其组织位置。空间转录组把 RNA 测量与二维或三维坐标连接，使组织区室、细胞邻域和分子梯度成为可分析对象。不同技术在“测多少基因、捕获多少分子、分辨到多细、覆盖多大面积”之间取舍；空间分辨率需要同时说明物理像素、有效捕获范围和一个测量单位中包含多少细胞。

经典空间转录组学（spatial transcriptomics）把带有位置条形码的寡核苷酸阵列置于组织切片下方，使每个捕获点（spot）获得的 RNA 在测序后回到组织坐标。⁴ Slide-seq 以密集的条形码微珠提高物理采样分辨率；多重误差稳健荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，MERFISH）则用抗误差组合条形码和多轮成像在单细胞内定位许多 RNA 分子。⁵⁶ 捕获式方法通常有较广的基因覆盖，成像式方法可保留单分子和亚细胞位置，但基因面板、光学密度与成像轮数各有约束。技术选择需要根据基因覆盖、分子灵敏度、空间尺度和视野面积共同权衡。

坐标、图像与质量控制¶

空间数据除表达矩阵外，还包含组织图像、捕获点／微珠坐标、切片方向、染色、分割掩膜（segmentation mask）和尺度信息。图像与表达坐标配准偏移会把 RNA 放进错误结构；组织折叠、裂隙、坏死和切片边缘改变捕获；相邻切片也对应不同的细胞层。分析应保留原始图像与变换矩阵，并在组织标志基因、形态边界和基准标记（fiducial marker）上检查配准。

捕获式数据可检查每位置总 UMI、检测基因数、线粒体／核糖体比例、组织内外背景、空间异常值和批次。低 UMI 既可能是技术失败，也可能是真实细胞稀少或 RNA 少的组织区；邻近高表达区域的 RNA 扩散可造成边界外拖尾。成像式数据还要检查每轮成像漂移、条形码解码错误（barcode decoding error）、点位密度、阴性探针、自发荧光（autofluorescence）和图像分割（segmentation）。一个 RNA 点被分到哪一个细胞，取决于核、膜或胞质边界模型；细长突起、多核细胞和拥挤组织使分割特别困难。

多个切片或个体的空间比较仍以生物样本为重复。同一切片中的数千捕获点共享空间自相关和制备过程，以它们作为独立样本会形成伪重复。模型可以显式加入空间邻接或随机效应，但实验单位仍是生物样本。组织区域面积、取样方向和病理分级必须在组间平衡或进入模型，否则“区域差异表达”可能只是切到了不同结构。

空间域、梯度与空间变异基因¶

空间邻接图把每个位置与物理近邻连接，表达和图像特征可共同用于识别组织域（domain）。离散域适合上皮—间质、皮层层次或肿瘤区室等相对稳定边界；发育形态发生素（morphogen）、缺氧和炎症浸润常形成连续梯度。聚类算法会把梯度切成若干区，因此区域数和边界需要与组织学、已知标志物和不同切片重复比较。

空间变异基因检验表达是否随坐标呈现非随机结构。局部热点、周期层次、长程梯度和边界富集需要不同核函数（kernel）或邻接模型；总 UMI、细胞密度和组织结构会形成共同空间趋势。显著空间自相关说明表达具有位置结构；产生信号的细胞类型和该基因对结构的因果作用需要进一步分析。把细胞类型组成、组织形态和细胞类型内表达分开，才能逐步缩小解释。

去卷积与单细胞参考映射¶

一个捕获点含多个细胞时，可用 scRNA-seq 参考中各细胞类型的表达谱估计组成比例。cell2location 等模型把参考特征谱（signature）、位置总量和技术变异放入计数模型，借助位置间信息估计细粒度细胞分布。⁷ 结果依赖参考是否覆盖当前组织的类型与状态、平台间基因检测差异、特征谱可辨识性和每位置细胞数先验。相近亚型共享大量基因时，可用于区分它们的信息可能不足。

另一方向是把每个单细胞表达谱映射到若干空间位置。Tangram 等方法以共享基因使单细胞和空间表达对齐，可把单细胞注释投射回组织，也可借助空间数据推断未测基因的候选模式。⁸ 这种映射是在相似性目标下得到的模型分配，表示与解离细胞表达相容的位置；参考来自不同个体、发育阶段或切片时，不确定性会进一步增大。预测的单细胞分辨率或未测基因应以原位杂交、成像基因面板、组织学或留出基因验证。

细胞邻域与相互作用推断¶

细胞类型在短距离内共同出现，可以定义邻域、生态位和界面。置换检验需保留组织结构、细胞密度和切片边界，否则常见细胞或大区室会天然产生大量邻近。配体—受体数据库可以把发送细胞的配体表达、接受细胞的受体表达与空间距离相交，形成候选信号边；完整信号链还包括蛋白分泌、成熟、到达受体和触发下游，数据库关系也可能缺少物种、亚基和细胞语境。

空间邻近比解离数据中的共表达增加了位置条件，能够界定“哪些细胞在何处有机会作用”。直接相互作用和因果方向还需蛋白定位、磷酸化或转录响应、阻断配体／受体、细胞类型特异扰动、时间顺序与救援（rescue）实验逐步验证。

多模态整合与结论边界¶

同一细胞可同时测量 RNA 与表面蛋白、染色质可及性、T 细胞受体（T-cell receptor，TCR）／B 细胞受体（B-cell receptor，BCR）序列或遗传扰动；不同细胞的多组学也可通过共同条形码、共同特征或统计映射整合。同细胞测量减少样本组成不一致，但每种模态（modality）的捕获深度通常下降，共同条形码说明信号来自同一细胞，直接分子作用仍需机制证据。跨细胞整合则依赖共享潜在状态、配对样本或已知特征关联，映射的不确定性应保留。

RNA 与转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing，ATAC-seq）峰的相关、转录因子基序、染色质接触和空间共定位可以组成候选调控链：某状态中增强子更开放，目标基因同时升高，二者在同类细胞和空间区域共现。这个链还可能由第三个因子共同驱动。遗传变异、成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）扰动、时间序列、位点编辑和救援实验能检验方向；多组学增加可相互约束的观测，因果结论仍由扰动与时间证据建立。

单细胞与空间结果还必须回到分子、细胞和组织尺度验证。原位杂交和成像可核对转录本位置，流式或组织计数检验细胞组成，蛋白定位与磷酸化检验信号链，功能扰动检验必要性和充分性。验证对象应覆盖不同丰度、细胞群、空间区域和机制层级，避免只选择 UMAP 或组织图上最醒目的标志物。

可复现分析与报告¶

单细胞项目应保存样本表、原始读段、参考和注释版本、条形码／UMI 结构、未过滤基因—条形码矩阵、细胞元数据、过滤与双细胞规则、原始计数、低维表示的生成步骤、随机种子以及聚类和注释版本。多个样本之间的整合还要保存未整合对象、批次／条件关系和用于条件检验的样本级计数；最终 UMAP 坐标应与这些中间对象和参数一同保存，才可复查完整分析链。

空间项目还应保存原始组织图像、切片方向、尺度、捕获点／微珠／分子坐标、分割掩膜、坐标变换、组织内外标记和去卷积或映射的模型输出。基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）、序列读取档案（Sequence Read Archive，SRA）／欧洲核苷酸档案（European Nucleotide Archive，ENA）等档案分别承接处理后矩阵、实验元数据与原始读段，图像和病理资料还要处理可识别信息与受控访问。命令行、环境、容器、工作流与来源追踪（provenance）的具体组织见命令行、工作流与可重复研究。

图表应让读者看见独立实验单位和空间尺度。单细胞结果应按样本分层显示细胞数、比例和伪批量变化，空间结果要同时给组织图像、尺度、切片身份和重复。无论细胞或位置数量多大，最终结论都应回到“测到了什么单位、在哪些独立样本中重复、模型假设是什么、还需要哪一种验证”。

参考资料与延伸阅读¶