分子进化与系统发育分析¶

分子系统发育分析把一组可比较的序列，转化为关于谱系分歧、性状变化和演化时间的统计推断。最终绘出的树呈现结果的一个切面，其拓扑和枝长同时受取样范围、同源关系、比对、替换模型、树搜索和定根方式影响。两个分析即使使用同一软件，只要这些环节不同，也可能回答不同的生物学问题。

以下计算工作流说明怎样从序列矩阵建立树、评价冲突、估计时间，并把树用于分子选择和群体历史分析。树所表达的共同祖先、单系群、祖征与衍征等系统学概念，见系统发育与生物分类；这里更关心每个计算对象怎样形成、算法假设怎样进入结果，以及输出能够支持到哪一层结论。

问题、取样与分析单位¶

分析首先要确定末端代表什么。末端可以是一条基因拷贝、一个单倍型、一个个体、一个物种或一个宏基因组组装基因组。以每个物种的一条序列建树时，树直接描述这些序列的历史；物种关系的推断还要求适当处理直系同源关系、谱系内取样和基因历史。混入旁系同源拷贝，会把一次古老基因复制误作物种分化；污染序列、错误拼接和样本标签错误则可能制造位置稳定但生物学上虚假的末端。

类群取样决定哪些分支能够被观察。研究群内部的少量近缘物种可能缺少定根和识别长枝所需的信息；单个很远的外群又容易受到多重替换和比对不确定性影响。合适的取样通常同时覆盖目标类群的主要分支、疑难节点附近的近缘类群和关系已较明确的外群。位点取样也有类似作用：一个短基因可能含有的有效变化很少，许多基因则可能携带彼此不同的历史。取样质量取决于类群和位点是否与问题匹配。

序列进入分析前应确认登录号、物种与拷贝身份、链方向、完整性和坐标，并保存取得日期与数据库版本。编码基因还要检查阅读框、提前终止和可能的假基因；基因组数据要说明使用哪个组装、单倍型和基因模型。序列搜索与直系／旁系同源判断的基础见序列比对与数据库搜索，基因家族与共线性证据见基因组组装、变异与比较分析。

比对、分区与可用位点¶

多序列比对（multiple sequence alignment，MSA）把各行序列放入共同坐标，使一列中的字符被解释为来自同一祖先位置的状态。位置同源是比对列进入建树模型的核心假设。高度可变区、长插缺、重复序列和结构域重排常有多种近似等价的比对；错误对齐会把非同源字符制造成大量变化，继而以很高支持度推动错误拓扑。比对算法、参数、手工修订规则和删除的区段都应记录，疑难区域可比较多种比对或把比对不确定性纳入敏感性分析。

修剪的目的在于排除无法可靠建立位置同源的列，同时保留能够区分短内枝的真实变化信号；明显错误的比对会积累系统偏差。自动工具给出的掩蔽结果需要回到原始比对、蛋白质结构域或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）二级结构检查。编码序列常先按氨基酸比对，再回译为密码子比对，以维持读框并减少非同源密码子的比较。

不同数据块可能遵循不同过程。密码子三个位置、不同基因、RNA 的茎与环、蛋白质不同结构域，可设为分区并分别估计替换速率或模型。分区太粗会让差异显著的过程被平均，分区太细则产生大量参数并放大短片段的估计误差。分区方案应来自序列结构和采样设计，再用信息准则、参数稳定性和生物学可解释性评估，每个小片段是否需要独立模型据此决定。

多数树模型还假定同一比对区段共享一棵树。重组会使断点两侧具有不同的祖先历史；把它们合并后，某棵折中树和后续 dN/dS 检验都可能受到误导。对于病毒、细菌交换片段或种内序列，应先用局部树、兼容性模式或 GARD 等方法寻找重组证据，再按问题分区、剔除重组体，或采用显式描述网络和局部谱系的方法。¹

观察距离与替换模型¶

两条等长序列中不同字符所占比例称为 p 距离。若有 \(L\) 个可比较位置，其中 \(n_d\) 个不同，则 \(p=n_d/L\)。它直观地记录了观察差异，却看不到同一位置发生两次以上替换、回复突变和平行变化，因此在分化加深时逐渐低估真实替换数。距离校正和基于字符的似然模型，都是要把观察到的状态与潜在替换过程联系起来。

JC69 假设四种核苷酸频率相等、六类替换率相同，是理解多重替换校正的起点。K80 区分转换与颠换；HKY 和 GTR 进一步允许不等碱基频率及更多替换率参数。位点间速率常以离散 Γ 分布近似，有些模型还设置不变位点类。蛋白质的 Poisson 模型把各种氨基酸替换视为等价，Dayhoff、JTT、WAG、LG 等经验矩阵则从不同序列集合估计交换倾向；针对膜蛋白、病毒或特定细胞器的数据还可能需要专用矩阵。编码序列的密码子模型同时描述同义与非同义变化，为后续选择分析提供基础。

模型选择与数据质量是两个独立环节。即使广义时间可逆模型加伽马分布（general time reversible model with gamma distribution，GTR+Γ）在候选集合中优于较简单模型，严重的碱基组成异质、替换饱和、谱系间速率过程变化或错误比对仍可能违反其假设。赤池信息准则（Akaike information criterion，AIC）、小样本校正 AIC（AICc）、贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion，BIC）或贝叶斯方法比较给定候选模型之间的相对支持；胜出模型的充分性还要通过组成检验、饱和模式、分区参数、异常长枝和不同模型下的拓扑稳定性评估。ModelFinder 等程序可以联合搜索常用替换模型与速率异质方案。²

树的拓扑、根与枝长¶

树包含彼此相关但含义不同的对象。拓扑描述末端怎样组成分支；枝长可以表示每个位点的预期替换数、时间或某种性状变化量；节点标签可表示自助法（bootstrap）支持度、后验概率或其他统计量。Newick 文件本身通常不说明这些数值的单位。阅读和交换树文件时，需要记录有根／无根状态、枝长单位、节点标签定义和末端名称映射。

候选拓扑的数量随末端数迅速增加。\(n\) 个有标签末端的完全二叉无根树有 \((2n-5)!!\) 种，有根树有 \((2n-3)!!\) 种。除很小的数据集外，穷举所有拓扑并不可行，最大简约、最大似然和贝叶斯程序都依赖启发式搜索或随机采样。多次独立搜索、不同起始树和相同得分拓扑的记录，因而是分析的一部分。

无根树表达分割关系，根决定变化方向和共同祖先的位置。外群定根利用研究群之外且关系适当的类群；外群过远时可能因比对困难和长枝吸引而错放，外群太近或实际落在研究群内部又无法提供预期方向。中点定根把根置于最长末端距离的中点，隐含近似时钟；时钟模型可在估计速率与时间的同时定根。定根方法应依据独立生物学信息，树图旋转只改变显示方向。

距离法与最小演化¶

距离法先把每对序列压缩成一个距离，再从距离矩阵恢复树。Fitch–Margoliash 一类加权最小二乘方法寻找树上路径长度与观察距离尽量一致的拓扑；最小演化法比较候选树的总枝长；邻接法（neighbor joining，NJ）逐步合并能最小化全树长度准则的末端或簇。它们计算迅速、输出直观，适合探索大型数据、检查样本身份，也在距离本身就是研究对象时保持优势。NJ 的统计表现取决于距离估计是否适合替换过程，而非某个固定的序列相似度区间。³

UPGMA 从最近的簇开始平均合并，并假定各末端到根的累计距离相等，即严格的超度量或分子钟条件。各谱系速率明显不同时，UPGMA 可能把速率相近而非亲缘最近的序列聚在一起。这个限制也使它成为理解分子钟的经典入口：一棵树只有在根到所有同时代末端的期望时间距离相容时，才能直接用这种层次聚类解释为时间树。

距离矩阵压缩了具体位置对分支的支持信息。不同变化模式可能产生相同的总距离，插缺和位点异质也需在矩阵计算前作出处理。距离树仍然可以使用 bootstrap，但重采样单位是比对列，每次都要重新计算距离并聚类。

最大简约与性状变化¶

最大简约法（maximum parsimony，MP）寻找解释观察性状所需变化步数最少的树。对脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白质或形态性状，可以在候选树上重建祖先状态并累加变化代价；至少有两个状态、且每个状态至少出现在两个末端的简约信息位点，才可能直接区分不同的二叉拓扑。等权简约把变化视为等代价，加权方案则可以区分转换、颠换或不同形态性状。

简约法把“少变化”直接连接到树长，便于追踪每个性状如何支持或反对某个分支，也能自然纳入形态离散性状。它在分支很长且速率不均时可能发生长枝吸引：相距较远的快速演化谱系因平行或回复变化而共享表观状态，被错误聚在一起。这个问题揭示的是未建模多重变化的系统偏差，增加位点后甚至可能更稳定地支持错误树。最大简约因此仍是重要的性状分析与方法比较路径，但适用性要由数据生成过程、同形性和取样检验，而非“序列相似度高”决定。⁴

最大似然搜索¶

最大似然（maximum likelihood，ML）在指定树、枝长和替换模型下计算观察到整份比对的概率，并寻找似然最大的参数与拓扑。Felsenstein 剪枝算法在树上递推整合未知祖先状态，使似然计算可用于实际数据。每个比对列对总对数似然的贡献还可以记录下来，用于比较候选拓扑、定位冲突区段和开展站点重采样。

明确替换模型后，ML 仍需在巨大的树空间中搜索。现代程序通常从距离树或简约树出发，通过最近邻交换（nearest-neighbor interchange，NNI）、子树剪切再嫁接（subtree pruning and regrafting，SPR）等局部变换搜索更优拓扑，同时更新枝长与模型参数。数据较难时，应运行多个起点或更充分的搜索，比较最优分数、近似最优树和关键节点，并记录搜索稳定性和备选拓扑。

PhyML 把快速似然搜索带入常用流程，RAxML 系列面向大规模高性能分析，IQ-TREE 将模型选择、树搜索、分区、支持度和拓扑检验组合在同一框架中。MEGA 从第 5 版起实现最大似然，并在 MEGA11 中继续改进大数据似然分析和时间树功能。图形界面便于教学和交互检查，正式报告仍要导出比对、树、模型、参数、随机种子和日志。⁵⁶⁷

贝叶斯推断与 MCMC¶

贝叶斯系统发育把树、枝长和模型参数视为未知量，以先验分布和序列似然形成后验分布：\(P(\Theta\mid D)\propto P(D\mid\Theta)P(\Theta)\)。MrBayes 常用于序列和形态性状的贝叶斯树推断；BEAST 则把替换模型、时钟模型、树先验和采样时间整合起来，尤其适合时间树与群体动力学。二者都使用马尔可夫链蒙特卡洛（Markov chain Monte Carlo，MCMC）从巨大的联合空间中采样。⁸⁹

后验概率表示在所给数据、模型和先验下某分支出现在后验样本中的比例。它与 bootstrap 支持度来自不同的重复过程，两者需要分别解释。先验会在数据较弱或参数相关时产生可见影响，因此应说明拓扑、枝长、时钟、群体过程和校准的先验，并进行先验预测或敏感性分析。

有效后验探索取决于链的混合与独立样本量，而非迭代总数。应比较独立运行是否到达相同分布，检查参数轨迹、预热期（burn-in）、有效样本量（effective sample size，ESS）、潜在尺度缩减因子以及树分裂频率的差异；混合差的参数可有极高自相关，使数百万次迭代只产生少量近似独立样本。共识树还应连同后验枝长或节点年龄区间、冲突拓扑和诊断结果一起报告。

经典软件与现代工作流¶

PHYLIP 把距离、简约、似然、重采样和共识程序组织成可组合的小工具，seqboot、各类建树程序和 consense 展示了经典流水线怎样逐步形成；PAUP* 以简约、距离和似然（parsimony、distance and likelihood）等多种准则和丰富的搜索选项服务系统学分析；PhyML 专注似然树；MrBayes 把贝叶斯推断带入广泛使用；MEGA 将序列编辑、距离、简约、似然、bootstrap 和分子演化统计置于交互环境。这些软件所对应的矩阵、树搜索、重采样与模型概念仍是理解现代分析的路径。¹⁰

现代程序把很多步骤自动化，每类数据仍需匹配相应模型和诊断。选择工具时应先列出数据类型、类群数与位点数、是否分区、是否含形态性状、是否需要时间树或物种树、计算资源和可复现要求，再比较程序实际支持的模型与诊断。贝叶斯 MCMC 和时间树可分别从 MrBayes 与 BEAST 的工作流理解。

Bootstrap 与分支支持¶

Felsenstein 的非参数 bootstrap 把比对列视为可交换的观测单位：从原比对的 \(L\) 列中有放回抽取 \(L\) 列，得到重采样矩阵；每个矩阵重新建树；某分支在重采样树中出现的比例作为支持度。它衡量在这套取样、比对、方法和模型下，有限位点扰动时分支恢复的稳定程度。标准 bootstrap 可以与距离、简约或似然建树结合。¹¹

重复次数控制支持度估计的蒙特卡洛精度，系统误差则需要另行诊断。若真实重采样比例接近 0.5，按二项近似，100 次重复的标准误约为 0.05，1000 次约为 0.016；所需次数应结合目标精度、停止准则和计算量决定。错误同源、组成偏差、长枝吸引或共同违反的模型，会在每次重采样中反复出现，产生很高而错误的支持。bootstrap 表示分支在重采样中的恢复比例，固定重复次数本身无法保证结果可靠。

UFBoot2 等近似方法通过复用似然计算显著加速大数据支持度估计，输出应明确标为超快速自助法（ultrafast bootstrap），并与标准 bootstrap 分开报告。严重模型违反和过度拟合仍会影响其校准，一些实现提供额外的 NNI 优化。分析报告还应说明重采样单位：拼接多基因矩阵按单个位点重采样，反映位点抽样误差；按基因或位点与基因分层重采样，则把基因间异质纳入另一个层次。¹²

候选拓扑、共识与冲突¶

树的不确定性常超过一个节点数字能够概括的范围。多个拓扑可能具有近似的似然或简约树长；严格共识保留所有候选树共有的分支，多数规则共识保留超过给定频率的分支。低支持节点可表示数据量不足、不同位点支持相反关系、快速辐射留下很短的内部枝，或模型无法描述数据。用多分叉表达未解决关系，能够避免完全二叉树掩盖这些原因。

候选拓扑已有明确来源时，可以用每个位点的对数似然和 Shimodaira–Hasegawa（SH）、近似无偏（approximately unbiased，AU）等检验评价某些树是否与数据明显不相容。检验结论限定于候选集合与所用模型。系统发育基因组数据还可报告位点一致因子（site concordance factor，sCF）与基因一致因子（gene concordance factor，gCF），分别描述决定性位点和基因树对某条内部枝的支持比例。一个分支可有很高 bootstrap，却只有少数基因一致支持；这提示拼接数据在大量位点下稳定，但基因间历史仍有实质冲突。

分子钟与时间树¶

序列树的枝长通常以每个位点预期替换数计量。将它换算为年或世代，需要替换率和时间校准。严格分子钟假设所有谱系共享一个速率；局部时钟允许预设的分支组具有不同速率；松弛时钟把各枝速率视为来自某个分布，可允许相邻枝相关或独立。模型增加灵活性也增加了时间、速率和先验之间的依赖，时间树应报告节点年龄的置信或可信区间，而非只给单个日期。¹³

校准可以来自化石、地质事件、已知分歧时间、实验速率，或具有不同采样日期且在这段时间内积累足够变化的序列。化石通常为某个冠群或干群提供最小年龄约束；使用前要说明标本身份、保存性状、系统位置、地层和年代依据，并区分硬界限与概率密度。把最古老已知化石年龄直接当作节点的精确年龄，会忽略化石记录不完整与谱系在首次发现之前已经存在的时间。¹⁴

多个校准和树先验联合作用后形成的实际联合先验，可能不同于逐个节点上指定的边际分布。应分别运行不含序列数据的纯先验（prior-only）分析，检查校准、时钟与树先验本身推导出怎样的年龄分布；再与后验比较，判断数据提供了多少信息。异时采样的病毒或古 DNA 还要先确认采样日期与遗传距离之间存在可测量的时间信号，并通过日期随机化等方法评估。BEAST、MEGA 的时间树模块和其他专用程序能够执行估计，生物学校准依据仍需研究者提供。

基因树、物种树与网状历史¶

一个基因座的共祖过程发生在物种分化过程之内。祖先种群中的多个等位谱系若在连续的短分化间隔中没有及时共祖，就会产生不完全谱系分选（incomplete lineage sorting，ILS），使基因树与物种树不同。基因复制与丢失、水平转移、杂交与基因渗入也会制造冲突；重组则可让同一基因内部存在多棵局部树。基因树和物种树的差异因此可能携带生物学信息，需要按这些过程分别解释。

拼接分析把多个位点连接成一个超级矩阵，可以联合估计拓扑并充分利用每个位点的信息，但通常假定各分区共享拓扑。多物种共祖模型则显式描述 ILS：先分别估计基因树，再由 ASTRAL 等汇总方法寻找与基因树四元组最相容的物种树；或在联合贝叶斯框架中同时估计。ASTRAL 的统计目标针对 ILS；错误直系同源、基因树估计误差、基因渗入或水平转移需要额外模型与检查。拼接树、共祖物种树、基因树一致因子与网络分析提供对不同过程敏感的互补视角。¹⁵

物种树上的短枝可以按共祖单位表达，即时间除以有效种群大小；此时短枝预期产生更强 ILS。若冲突集中在基因组某些区域并与连锁成块，基因渗入或重组更值得考虑；若复制家族中拷贝数和共线性同时变化，则应进行基因树—物种树 reconciliation。涉及共同祖先、基因流和中性过程的机制见遗传变异与群体进化过程。

dN/dS 与密码子模型¶

编码序列中，\(d_N\) 表示每个非同义位点的非同义替换率，\(d_S\) 表示每个同义位点的同义替换率，二者之比 \(\omega=d_N/d_S\) 用同义变化近似标定突变与漂变背景。\(\omega<1\) 常见于净化选择，\(\omega\approx1\) 与近中性变化相容，\(\omega>1\) 可支持有利于氨基酸改变的多样化选择。该比值比较经过机会位点和多重替换校正的速率，而非非同义与同义突变的原始个数。

整个基因的一项平均值会混合不同位点和时期。少数位点在一条分支上经历正选择时，大量保守位点仍可令全基因 \(\omega<1\)。分支模型（branch model）比较谱系间的 \(\omega\)，位点模型（site model）比较位点类别，分支—位点模型（branch-site model）寻找指定前景分支上特定位点的变化。HyPhy 的固定效应似然（Fixed Effects Likelihood，FEL）检测贯穿树的位点选择，混合效应演化模型（Mixed Effects Model of Evolution，MEME）面向一部分分支上的间歇性位点选择，自适应分支位点随机效应似然（adaptive Branch-Site Random Effects Likelihood，aBSREL）面向分支，分支位点无限制统计检验（Branch-site Unrestricted Statistical Test for Episodic Diversification，BUSTED）检验某基因是否在任一前景分支和位点经历过多样化选择。每个方法的零假设与结论单位不同，BUSTED 显著定位的是基因层面的选择证据。¹⁶

密码子模型依赖正确读框、可靠密码子比对、适当树和替换模型。\(d_S\) 饱和会使分母不稳定，密码子偏好、GC 偏向基因转换、群体多态性、测序错误和重组都可能改变估计。对许多基因、分支或位点检验还需控制多重比较，并报告似然比检验、边界参数使用的零分布和模型敏感性。分子层面的选择证据如何与表型和适合度连接，见自然选择、适应与约束。

Tajima's D、Fu–Li 检验与 MK 检验¶

系统发育树比较谱系间替换，种群统计则利用同一物种样本中的多态性。Tajima's D 比较两种对群体突变参数的估计：平均成对差异 \(\pi\) 对中频变异权重较大，Watterson 估计量 \(\theta_W\) 由分离位点数得到。标准化后的 \(D\) 在中性、群体大小恒定、随机交配且无重组等参考模型下期望接近零。¹⁷

\(D<0\) 表示相对于 \(\pi\)，分离位点数偏多，即低频变异过量；近期群体扩张、近期选择扫荡和背景选择都可能产生这种模式。\(D>0\) 表示中频变异相对过量，可见于群体收缩、隐蔽群体结构或平衡选择。这个符号方向来自频率谱的权重差异。一个显著 D 值说明数据偏离给定参考模型，其多种可能原因需要用群体结构、重组率、连锁范围和基因组背景进一步区分。

Fu and Li's D、D、F、F 比较外部枝上新近突变与树内较老突变的相对数量，其中部分版本需要外群判断祖先状态，带星号版本不使用外群。它们对稀有变异敏感，也会同时响应群体增长、搭便车和背景选择。序列错误和低覆盖基因型会优先制造单例，因此质量过滤、缺失模式、样本量和可调用区域必须进入零分布或模拟。¹⁸

McDonald–Kreitman（MK）检验把种内多态与种间固定差异分开，再把每类分成同义和非同义，形成 \(2\times2\) 表。中性模型下，非同义／同义比在多态与固定差异中应相近；固定非同义差异相对过量支持适应性固定。轻微有害的非同义多态、群体史、外群分歧时间和基因转换都会改变表格比例，扩展方法常按派生等位基因频率过滤或联合多个基因估计适应性替换比例。MK 检验以群体内变化作为近期参照、种间差异记录长期固定；具体表型适应还需要性状与适合度证据。¹⁹

选择扫荡与群体历史¶

选择扫荡发生时，有利等位基因频率快速上升，其邻近连锁变异随之搭便车。经典硬扫荡从一个新突变开始，常留下局部多样性下降、低频与高频派生等位基因偏移以及较长单倍型；软扫荡可由站立变异或多个独立突变产生，保留更多单倍型背景。检测方法分别利用位点频率谱、连锁不平衡、单倍型长度、群体分化或多种信号的复合似然，因而对扫荡时间、强度和重组率有不同灵敏度。

人口扩张会在全基因组产生稀有变异过量，瓶颈可造成多样性损失和连锁升高，群体混合又可增加中频变异；这些模式可能与局部选择相似。背景选择在低重组区持续清除有害等位基因，也会降低相邻中性多样性。可靠分析先用较广泛、尽量中性的位点拟合人口史和可调用区域，再在包含重组率、突变率和背景选择差异的模拟或经验背景中寻找局部异常。群体结构、近亲、相位误差和测序批次也要与选择模型共同检查。

历史推断的时间尺度由数据决定。位点频率谱对较久远的群体大小变化有信息，长共享单倍型更敏感于近期事件，成对顺序马尔可夫共祖方法利用沿基因组变化的局部共祖时间。共享同一批样本的方法产生相关证据；比较结果可以显示哪些历史特征在不同摘要统计下稳定，哪些结论依赖突变率、重组图、世代时间或群体模型。

可复现分析与结果报告¶

一项可复查的系统发育分析应从原始序列清单开始，记录样本与物种元数据、登录号和版本、同源与直系同源判据、过滤记录、原始和修订比对、分区文件、模型候选与选择准则、软件版本和完整命令、随机种子、起始树、搜索日志、最优树、重采样树及支持度定义。图中还要标明根、枝长标尺、被折叠的分支、节点数值类型和缺失类群。若对齐、过滤或模型存在合理替代方案，应把关键拓扑的敏感性纳入结果，并完整保留各次运行。

时间树还需报告每个校准的标本或采样日期依据、节点对应关系、先验分布、时钟与树模型、prior-only 检查、MCMC 诊断和年龄区间。基因树—物种树分析要提供各位点边界、基因树估计方法、冲突指标和使用的共祖或网络模型。选择与群体分析则应保存祖先状态来源、可调用区域、重组与群体结构处理、零模型、模拟参数、多重校正和完整统计结果。

最后的解释应保持对象一致：序列树首先支持所分析拷贝的分支关系，物种关系需要额外的基因历史模型；高支持度说明在既定分析框架下稳定，共同的系统偏差仍需单独诊断；\(\omega\)、Tajima's D 或扫荡统计量指出与某个参考过程的偏离，选择、人口史和重组之间仍需比较。这样得到的树和统计量构成一套可继续检验的演化假说。

参考资料与延伸阅读¶