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细菌与噬菌体遗传分析

细菌通常是单倍体，也没有可供常规测交观察的减数分裂，但它们能以接合、转化和转导接受外源 DNA。遗传学家把这些转移过程改造成可控的“杂交”：先用营养缺陷、抗性或噬菌斑表型标记亲本，再选择获得某一供体标记的受体，最后根据其他标记共同进入、重组或互补的频率推断基因顺序。噬菌体还能在一个宿主细胞内形成大量可重组基因组，使极罕见的基因内交换也能被选择出来。

这一分析框架始终区分三个事件。DNA 进入受体只是转移；进入的片段与染色体交换、或作为复制子稳定维持，才形成可遗传的新基因型；外源等位基因表达为可检测表型，还可能经历转录、翻译和表型延迟。把三个事件分开，才能判断一次实验测到的是转移顺序、稳定重组、功能互补，还是短暂表达。

选择与筛选把基因转移转化为遗传证据

细菌作图通常让供体携带野生型代谢等位基因，受体携带相应营养缺陷突变。例如在缺少色氨酸的培养基上，只有获得并稳定保留 \(trp^+\) 的受体能形成菌落。这里的选择（selection）决定哪些细胞可以生长；随后检测同一菌落是否还获得 \(leu^+\)、\(lac^+\) 等未选择标记，属于筛选（screening）。共转移率应写成条件频率，例如

\[ P(B^+\mid A^+)=\frac{N(A^+B^+)}{N(A^+)}. \]

分母必须是按 \(A^+\) 选出的受体，而不是全部混合细胞。交换供体与受体、改变选择标记或改变培养条件，都可能改变回收率；可靠的基因顺序通常来自多组互为补充的选择，而不是一张平板上的最高百分比。

供体本身还须被反选择。经典设计可让供体对链霉素敏感（Str\(^S\)）、受体对链霉素抗性（Str\(^R\)），接合后在含链霉素并缺少特定营养物的培养基上同时淘汰供体和未获得目标标记的受体。链霉素只是这一特定菌株组合中的反选择工具；任何不会干扰待测重组体、又能区分亲本的独立标记都可承担同一角色。表型显现所需时间、等位基因显隐性、受体背景突变和自发耐药均应设置对照。1

外源片段必须建立才能稳定遗传

接合、自然转化和广义转导常把一段不能独立复制的供体染色体 DNA 送入受体。在线性供体片段两侧与受体染色体发生同源交换，可用供体区段替换相应受体区段；未整合片段会被降解，或随细胞分裂稀释。受体完整染色体历史上称内基因子（endogenote），暂时进入的供体片段称外基因子（exogenote），二者并存的细胞可称部分二倍体或部分合子（merozygote）。能自主复制的质粒、完整噬菌体或整合型移动元件则有不同的建立途径。

线性片段替换环状染色体的一段时，教材常画出位于片段两侧的两次交换；这说明为何只能回收一个嵌合受体染色体，而不会像减数分裂一样同时得到互补的另一种重组产物。实际末端会被 RecBCD 等系统加工，链侵入、复制与错配修复也能形成更复杂的产物。因而，“奇数次交换必使细菌染色体线性化并致死”不是普遍规则；观察到的非互易性主要来自只追踪受体复制子、而未整合供体 DNA 被丢失这一实验结构。具体链交换反应见DNA 重组与转座。

接合将供体复制子的次序转化为时间图

接合依赖细胞接触和可接合元件编码的转移装置。以大肠杆菌 F 因子为经典模型，F\(^+\) 供体的 relaxase 在转移起点 oriT 切开一条 DNA 链，转移链经 IV 型分泌系统进入 F\(^-\) 受体；供体以滚环相关复制补回被转移链，受体合成互补链并使质粒闭环。完整 F 因子建立后，原受体成为 F\(^+\)。F 菌毛参与最初接触，稳定配对和 DNA 通道还依赖多种 Tra 蛋白；其他细菌的接合元件可采用不同黏附结构和调控方式。2

Hfr 把染色体接到 oriT 之后

F 因子与大肠杆菌染色体上的同源插入序列重组后，可整合为高频重组（high frequency of recombination，Hfr）供体。转移仍从 F 内部的 oriT 开始，却随即沿整合方向进入相邻染色体。F 插入位置决定第一个进入的染色体标记，插入方向决定后续顺序；不同 Hfr 株因整合位点和方向不同，会给出彼此重叠而起点、方向各异的转移片段。

完整大肠杆菌染色体转移需要的时间远长于多数配对持续时间，留在转移末端的 F 区段也很少完整进入。因此，Hfr\(\times\)F\(^-\) 接合通常得到含一段供体染色体的 F\(^-\) 重组受体，而不是把受体普遍转成 F\(^+\)。越靠近 oriT 的标记越早进入，也越有机会在配对中断前到达受体；这同时造成时间顺序和回收频率梯度。

中断杂交读取进入时间

中断杂交把 Hfr 与 F\(^-\) 受体混合，在一系列时间点取样，以强烈剪切分开配对细胞，再反选择供体并分别选择不同供体标记。某标记的重组受体首次稳定出现的时间近似该标记的进入时间；多个标记的首次出现次序给出从 oriT 出发的线性顺序，时间差以分钟表示相对距离。使用不同 Hfr 株所得的重叠时间图可拼接出大肠杆菌环形遗传图。Wollman、Jacob 与随后对接合动力学的实验正是凭借这种定向进入建立了细菌染色体的连续图。3

“分钟”首先是规定温度、培养基和菌株下的转移时间，不是固定的碱基对换算。配对建立的延迟、DNA 转移速度、片段整合概率、标记表达延迟和选择培养基上的生长均会移动检测曲线。相距太近的标记可能在时间分辨率内同时出现，此时可选择其中一个标记，再筛查邻近未选择标记的共继承率；这一频率还受同源交换位置与标记本身的选择影响，不能直接当作真核重组分数。

F′ 因子建立稳定的部分二倍体

整合 F 因子精确切出时恢复普通 F 质粒；罕见的不精确切出会把邻近染色体区段一并带入质粒，形成 F′ 因子。F′ 转移到受体后可自主复制，使受体同时含有染色体等位基因和 F′ 携带的供体等位基因，形成稳定部分二倍体；这一过程称性导（sexduction）。F′ 的来源取决于整合与异常切出的边界，不能用“单交换形成 Hfr、双交换形成 F′”作为普遍判据。4

部分二倍体让两个等位基因在同一细胞中表达，可用于判断显隐性、顺式调控与反式作用，也可完成互补测验。若 F′ 与染色体携带足够同源序列，它还可能再次整合或与染色体交换；分析前须确认观察到的是稳定质粒互补，还是已经形成染色体重组体。

自然转化以供体片段长度界定局部连锁

自然转化是细菌在自然感受态下摄取环境 DNA，并使其进入可遗传状态的过程。许多物种的双链 DNA 先在细胞表面被捕获，跨膜时一条链被降解，另一条单链由 DprA、RecA 等蛋白保护并导向同源重组；革兰氏阴性菌还须跨越外膜。供体链与受体链形成的异源双链若含等位差异，错配修复的方向或后续复制分离会决定最终保留哪一种序列。另一些系统偏好本物种富集的 DNA uptake sequence，质粒的建立也可能要求完整的互补链和可用复制起点。共同的结果是“摄取”“染色体整合”和“质粒转化”不能视为同一条固定路线。5

感受态是受调控的生理状态。肺炎链球菌以群体信号启动短暂的 competence regulon，枯草芽孢杆菌只有一个细胞亚群进入感受态，霍乱弧菌可受几丁质和群体感应信号调节；诱导线索随物种而异。自然转化发生的生长阶段因物种和条件而异。实验室 Ca\(^{2+}\) 处理、电穿孔等人工感受态则是工程化导入 DNA 的方法，其成功本身不能证明该物种具有自然转化系统。

共转化区分同一片段与独立摄取

两个标记若位于同一供体 DNA 片段上，一次摄取和整合便可能同时转移二者，形成共转化。选取 \(A^+\) 转化子后，\(P(B^+\mid A^+)\) 越高，通常表示两标记越可能落在可摄取片段的共同范围内。若 \(A^+\) 与 \(B^+\) 来自两个独立 DNA 分子，在低 DNA 浓度、独立摄取的近似下，双转化概率随浓度近似二次下降；来自同一物理片段时，共转化与单标记转化更接近同阶变化。这是稀释实验区分连锁共转化与偶然双摄取的依据。

共转化率同时取决于供体 DNA 的断裂分布、片段长度、摄取偏好、同源区长度和选择标记位置。它适合排列彼此很近的标记，却没有跨物种通用的“频率—碱基距离”公式。通过不同片段制备、互换选择标记和三标记组合验证顺序，才能把某一次共转化率转化为稳健的局部图。

转导以噬菌体包装范围抽样细菌染色体

转导是噬菌体颗粒把供体细菌 DNA 带入受体的过程。它与“用两个噬菌体突变株互相杂交”是两类实验：前者以噬菌体为细菌基因的载体，目标是获得细菌转导子；后者直接分析噬菌体自身基因组的重组与功能。

广义转导允许任意区域进入包装样本

在 P1、P22 等广义转导系统中，少数颗粒错误包装宿主染色体片段而非完整噬菌体基因组。具体来源取决于包装起点、headful 机制和宿主 DNA 状态；常见示意图所画的“噬菌体先把全部宿主染色体随机切碎”并非所有系统都已证实。一个转导颗粒所容纳的 DNA 长度有限，因此染色体上距离近的标记更可能位于同一片段。6

实验上先选择获得供体 \(A^+\) 的稳定转导子，再筛查其中 \(B^+\) 的比例。较高的 \(P(B^+\mid A^+)\) 支持两标记较近，但不同标记的回收、包装偏好和交换边界会使互换选择后的数值不完全对称。三因子转导通过比较各选择条件下四种未选择标记组合来定位中间标记；最稀有类别只有在亲本构型、选择方向和整合所需交换均明确时才可用于判序。依赖固定包装长度和随机断裂的 cotransduction mapping function 只适用于满足其假设的系统，不应作为所有噬菌体的通式。

供体片段进入却未整合时，可发生流产转导（abortive transduction）：非复制片段在后代中不对称保留，供体基因产物随分裂逐渐稀释，选择平板上可能形成很小的菌落。稳定转导必须证明后代持续遗传目标标记，不能只看一次短暂表达。

特殊转导只带走整合位点邻近区域

温和噬菌体从特定位点异常切出时，可能丢失一段噬菌体 DNA 并带走邻近宿主 DNA，形成特殊转导颗粒。它只能高频转移原噬菌体整合位点附近的少数基因，且颗粒常因缺少必要噬菌体基因而需要辅助噬菌体。广义转导以包装范围抽样许多染色体位置，特殊转导以异常切出边界限定邻近基因；二者的“专一性”来自不同步骤。

接合、转化和转导最终都受到限制修饰、CRISPR–Cas、外源 DNA 降解、序列差异和复制子相容性的筛选。转移范围和稳定重组可用于读取遗传图；这些过程在自然群落中的传播、耐药与毒力后果见微生物遗传与菌种改良。

噬菌体突变型提供高通量遗传读出

噬菌体的一个感染性单位在细菌菌苔上形成噬菌斑。斑块大小、边缘和透明度可标记裂解过程差异；宿主范围突变可由能否在不同菌株上成斑判断；温度敏感突变在许可温度生长而在限制温度失败。抑制子敏感突变则依赖宿主背景，例如 amber 无义突变可在携带相应抑制 tRNA 的许可宿主中被读穿，在无抑制子的宿主中暴露条件致死表型。每种读出都把基因型与特定宿主、温度和培养条件绑定，不能把“无噬菌斑”直接等同于某一个复制步骤缺陷。

温和噬菌体还可形成溶原菌。原噬菌体的阻遏蛋白使宿主对相同或近缘噬菌体具有特异性超感染免疫；DNA 损伤可诱导部分系统进入裂解生长，丝裂霉素 C 因造成 DNA 损伤而常用于实验诱导。这些性质既能提供选择背景与遗传标记，裂解—溶原决定、宿主范围和溶原转换的生物学也见病毒与亚病毒因子。

混合感染分开重组距离与功能单位

让两个带不同标记的噬菌体共同感染许可宿主，可在同一细胞内产生亲本基因组、复制中间体和重组基因组的群体。实验须控制两亲本滴度、吸附效率、感染复数（multiplicity of infection，MOI）、潜伏期和宿主状态，确保足够多细胞同时获得两类亲本。若两类噬菌体独立吸附且平均 MOI 分别为 \(m_1\) 和 \(m_2\)，两类均至少进入一个颗粒的理想概率为

\[ P(\text{coinfection})=(1-e^{-m_1})(1-e^{-m_2}), \]

但吸附异质性、排斥和超感染免疫会使实际值偏离 Poisson 近似。

重组测验读取标记的空间关系

设亲本为 \(a^+b\) 与 \(ab^+\)，若四种后代都能区分，则重组频率为

\[ R=\frac{N(a^+b^+)+N(ab)}{N_{\mathrm{total}}}. \]

若选择系统只检出野生型 \(a^+b^+\)，有时以 \(2N(a^+b^+)/N_{\mathrm{total}}\) 估计 \(R\)；这个倍增要求互补的双突变重组子与野生型等概率产生、且各基因型在扩增和检测中没有差异。亲本比例不等、标记影响适合度或宿主只允许部分基因型成斑时，必须直接校正而不能机械乘二。

噬菌体 DNA 在一次感染中复制多轮并可反复重组，晚包装基因组经历的交换机会通常多于早包装者；同一细胞中的亲本数和比例也各不相同。观察到的 \(R\) 因而不是两个染色体在一次减数分裂中交换的简单概率，长区间还会隐藏偶数次交换。T4 的精细图需要在受控 MOI、亲本比例和裂解时间下使用相应 mapping function；原始百分率只有在非常近的标记和相同实验体系中才可近似比较距离。7

互补测验读取基因产物的功能关系

重组产生一个新的共价 DNA 分子，后代仍可保持该组合；互补则是同一感染细胞中两个突变基因组分别提供可扩散功能，使当代感染恢复某种表型，不要求两段 DNA 交换。斑点测验可把两个突变体混合滴加到限制宿主菌苔上：将两个隐性功能缺失突变置于反式共同感染时，若恢复裂解或形成噬菌斑，二者通常属于不同互补组；若不能恢复，则支持它们影响同一功能单位。把两突变置于同一基因组、并由另一基因组提供相应野生型等位基因的顺式对照，可验证宿主与感染条件允许功能表达。由顺反测验定义的功能单位称顺反子（cistron）。

阴性互补还可能来自显性负效应、极性突变、产物不能跨基因组共享、蛋白复合物装配顺序或表达量不足；阳性互补也可能发生在同一基因内部。基因内互补常见于多聚体蛋白的不同亚基分别损伤不同结构面，混合多聚体恢复部分功能；它并不只限于某一类错义突变，也不保证活性一定远低于野生型。互补组是特定测定条件下的功能分类，现代基因还可能含多个产物、顺式作用序列或重叠阅读框，不能把顺反子无条件等同于一个固定 DNA 边界。

T4 rII 系统把极低频重组变成可选择事件

Benzer 的 T4 \(rII\) 系统利用两类宿主形成强选择：\(rII\) 突变体可在大肠杆菌 B 中增殖，却不能在限制性的大肠杆菌 K-12(λ) 上形成噬菌斑；\(r^+\) 可在两者生长。两个不同 \(rII\) 突变体先共同感染许可宿主 B，产生的全部后代可在 B 上计数，其中罕见 \(r^+\) 重组子再由 K-12(λ) 选择。海量噬菌体后代与选择性宿主使基因内部相距极近的突变也能被排序，证明一个功能区域在突变与重组尺度上可以继续细分。8

互补测验进一步把 \(rII\) 区分为 \(rIIA\) 与 \(rIIB\) 两个顺反子：不同顺反子突变在同一限制宿主细胞中可互补，同一顺反子突变通常不能。重组测验回答两个突变位点在 DNA 上的距离，互补测验回答它们能否共同恢复功能；两者结果相似时仍来自完全不同的证据。

缺失作图以重组有无逐级缩小区间

一组端点已知、彼此重叠的缺失可先把未知点突变定位到较小区间。点突变若落在某一缺失覆盖范围内，该缺失基因组没有相应野生型序列可供交换，交配通常不能产生野生型重组子；点突变位于缺失之外时，适当交换仍可恢复野生型。先用大缺失分区，再用嵌套小缺失定位，可避免对每一对点突变都进行定量杂交。

“未观察到重组”只把频率限制在样本检测下限以下。缺失端点、重复序列、重组热点、标记回变和选择效率都会影响判断；Benzer 的精细图之所以有高分辨率，既依赖缺失集合，也依赖能从巨大后代群体中选择极少量 \(r^+\) 的宿主系统。

λ 噬菌体连接染色体定位与定向重组

λ 进入溶原途径后以原噬菌体形式稳定存在于大肠杆菌染色体。若携带 λ 原噬菌体的 Hfr 供体与无 λ 免疫的 F\(^-\) 受体接合，含原噬菌体的染色体区段进入缺少足量 λ 阻遏蛋白的受体后可启动裂解发育，形成合子诱导（zygotic induction）。接合子裂解会阻止更晚的供体标记被回收；原噬菌体进入时间和其后标记的缺失模式因而可用于定位。这个经典实验同时表明，溶原状态依赖可在细胞质中发挥作用的阻遏因子，而不只是原噬菌体 DNA 自身不变的属性。9

λ 的整合是定向的位点特异性重组：环状噬菌体的 \(attP\) 与细菌的 \(attB\) 在 integrase（Int）和宿主 IHF 参与下重组，生成夹在原噬菌体两侧的 \(attL\) 与 \(attR\)。诱导后的切出由 \(attL\times attR\) 恢复 \(attP\) 与 \(attB\)，除 Int 和 IHF 外还需要 λ 的 excisionase（Xis），并受 Fis 等宿主因子调节。辅助蛋白和复合物拓扑赋予反应方向性；它不是“整合体内任何位置均可交换”的一般同源重组。10

λ 在裂解生长中还会复制并可发生同源重组，早期环状复制向后期 concatemer 形成与包装的转换属于其生活史。整合、切出和合子诱导可用于遗传定位；反应化学见DNA 重组与转座，复制周期与宿主关系见病毒与亚病毒因子。

参考资料与延伸阅读

  1. Brown 的细菌遗传作图章节区分接合的进入时间图与转化／转导的短片段共转移图，并说明稳定染色体重组须把供体区段接入受体复制子。 ↩

  2. Virolle 等的接合综述以 F 类质粒说明 relaxosome、oriT、IV 型分泌系统、转移链和受体互补链合成，并比较不同革兰氏阴性菌系统。 ↩

  3. Fisher 的接合动力学实验验证 Hfr 标记按固定顺序进入，并显示温度、有效接触、转移速度和表型显现会分别影响时间曲线。 ↩

  4. NCBI Bookshelf 的细菌遗传学章节说明 F 的整合位置与方向决定 Hfr 转移，异常切出携带邻近染色体片段形成 F′，后者可建立稳定部分二倍体。 ↩

  5. Johnston 等的综述比较跨物种共有的单链摄取—同源整合装置与高度多样的感受态诱导调控；DNA uptake sequence 与感受态的物种差异另见 Mell 与 Redfield 的综述。 ↩

  6. Chiang、Penadés 与 Chen 的转导综述区分广义、特殊及非经典转导，并指出“先普遍降解宿主染色体再随机包装”的常见图示并非广义转导的通用实证机制。 ↩

  7. ASM 的 Molecular Biology of Bacteriophage T4说明一次感染内的重复配对、复制、包装时序和感染复数使原始重组比例不能直接等同遗传距离，并讨论相应 mapping function。 ↩

  8. Benzer 的原始论文利用选择性宿主从大量 T4 后代中检出极少数 \(r^+\)，将重组定位推进到基因内部；未检出重组只给出由样本量决定的距离上限。 ↩

  9. Fisher 对 Hfr 接合动力学的研究列出 Jacob 与 Wollman 的合子诱导工作并将其用于定向进入解释；合子诱导的核心是原噬菌体区段进入缺少 λ 免疫的受体后启动裂解发育。 ↩

  10. Landy 的λ 位点特异性重组综述说明 \(attP\times attB\) 整合生成 \(attL/attR\)，切出还需要 Xis；方向性来自 Int、IHF、Xis、Fis 与位点臂共同装配的不同复合物。 ↩

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