逆转录¶

在DNA 复制中，我们一直让 DNA 指导新 DNA 的合成。把模板换成 RNA，会发生什么？只要酶能识别 RNA–DNA 的引物—模板接头，DNA 仍然可以从配对好的 3′-OH 继续延长，原料也仍是 dNTP。反应没有要求模板必须与产物穿同一身衣服。

逆转录（reverse transcription）就是以 RNA 为模板合成 DNA。催化它的逆转录酶（reverse transcriptase，RT）广泛出现在病毒、移动遗传元件以及某些细胞系统中。许多 RT 还能够以 DNA 为模板合成 DNA；在一个完整的逆转录过程中，两种模板甚至会轮流上场。

这里的“逆”是相对于通常从 DNA 转录 RNA 的方向而言，新生 DNA 的增长仍然是 5′→3′。它也没有推翻中心法则：RNA 序列可以传给 DNA，与蛋白质序列不能作为模板逐位回写核酸，是不同的问题。

在病毒颗粒中找到 RNA 依赖的 DNA 合成¶

1970 年，Temin 与 Mizutani、Baltimore 分别在 RNA 肿瘤病毒颗粒中检测到 RNA 依赖的 DNA 聚合活性。这个发现为“RNA 病毒可以经 DNA 中间体延续”的认识提供了酶学证据。先看 Baltimore 实验中的一组曲线，比直接记住这一句话更容易理解它的分量。¹

实验给病毒颗粒提供四种 dNTP，其中 dTTP 带有放射性标记，再检测进入酸不溶性产物的放射性。未作 RNase 处理时，信号随时间上升；在反应中加入 RNase，合成受到抑制；若先用 RNase 处理，再开始反应，抑制更明显。水预孵育则帮助分辨预处理操作本身的影响。

这表明，合成过程依赖可被 RNase 破坏的 RNA 组分。连同对产物为 DNA 等性质的鉴定，才能把结论落到 RNA 依赖的 DNA 聚合。实验曲线记录的是放射性进入产物，并没有直接拍到一个 RT 分子沿 RNA 行走；观察与机制之间，仍有需要逐步验证的联系。

先认清 RNA 和最终 DNA 的两端¶

以 HIV-1 为例，病毒颗粒携带两份正链 RNA 基因组和宿主来源的 tRNA。RNA 需要经过逆转录，变成可供整合的线性双链 DNA。初看反应图会遇到一串小方块：R、U5、PBS、PPT、U3……它们不是在提醒读者缩写还没背够，而是在标记复制过程中要重新对齐的序列。

先把 RNA 从 5′ 到 3′ 的次序写出来。中间的大段编码区暂时省略，只留下理解末端复制所需的位置：

RNA：5′—R—U5—PBS—……—PPT—U3—R—3′

R 是两端共有的重复序列；U5 原来只在 RNA 的 5′ 端附近，U3 原来只在 3′ 端附近。PBS（primer-binding site）是与 tRNA 引物配对的位置；PPT（polypurine tract，多聚嘌呤区）则与后面正链 DNA 的引发有关。

最终双链 DNA 两端各有一个完整的 LTR（long terminal repeat，长末端重复），每个 LTR 都由 U3—R—U5 组成。只写与 RNA 同向的那条 DNA，就能看出变化：

DNA：5′—[U3—R—U5]—PBS—……—PPT—[U3—R—U5]—3′
           左侧 LTR                     右侧 LTR

注意，RNA 原先两端分别是 R—U5 和 U3—R，尚不是各自完整的 U3—R—U5。逆转录需要把原来分居两端的序列安排到两个完整末端中。两次链转移，正是理解这个结果的关键。³

从 tRNA 起步，再作第一次链转移¶

HIV-1 常用宿主 tRNA\(^{\mathrm{Lys3}}\) 的 3′ 端作引物，其他逆转录病毒可使用不同种类的 tRNA。tRNA 与 PBS 配对后，RT 从这个 3′-OH 开始合成与基因组 RNA 互补的负链 DNA。

下图红色表示 RNA，蓝色表示 DNA。首先看最上方：引物靠近 RNA 的 5′ 端，而合成沿模板朝它的 5′ 端推进。于是 RT 先复制 U5 和 R，很快就用完了这一侧的模板，得到一小段负链强终止 DNA（minus-strand strong-stop DNA）。不是酶跑累了，是前面已经没有这条 RNA 可以读了。

RNase H 清除相应的 RNA 后，新合成 DNA 的 R 互补序列暴露出来。RNA 的另一端也有 R，它便能在那里重新配对；新生 DNA 的 3′ 端得到了可继续读取的模板。这就是第一次链转移，也称负链转移。

转移可以发生到同一条 RNA 的另一端，也可以利用颗粒携带的另一份 RNA。这里移动的是带着已合成 DNA 的引物—模板关系，DNA 不需要从头另抄一份 U5。先前抄好的序列跟着它一起保留下来。³

负链继续延伸，RNA 留下一段作正链引物¶

第一次转移后，负链 DNA 可以从 RNA 的 3′ 端附近继续复制 U3 及更前方的序列，逐渐向 RNA 的 5′ 端延伸。沿途形成 RNA–DNA 杂交，RNA 模板又被 RNase H 逐步处理。

大部分 RNA 会被移除，但 PPT 区域可以留下适合引发的 RNA 片段，提供新的 3′-OH。RT 从它开始，以已经形成的负链 DNA 为模板，合成正链 DNA。到这里，同一种酶已经在用 DNA 指导 DNA 合成了。

正链合成复制负链上的 U3、R、U5，随后复制仍与负链相连的 tRNA 引物中的相应一段，得到 PBS 对应序列。与此同时，负链继续复制基因组 RNA 另一端的 PBS，最终两条 DNA 的末端便有了可以相互配对的 PBS 序列。

第二次链转移，把两条 DNA 接成完整模板¶

tRNA 和正链 RNA 引物被处理后，互补的 PBS 区域可以彼此退火，使正链的 3′ 端转到负链另一端对应的位置，形成第二次链转移，也称正链转移。两条 DNA 随后互相充当模板，从各自的 3′ 端继续延伸，补齐缺少的部分。

现在再回头数 U3 和 U5，就能解释它们为什么各出现在两个末端。第一次转移让负链把 RNA 两端的序列接入同一份 DNA，正链合成和第二次转移再使这些序列在最终双链两端补齐。把“逆转录”只画成 RNA 下方长出一条互补 DNA，会漏掉这套末端重建过程。

最后的病毒 DNA 由整合酶（integrase）及宿主相关反应完成整合，这属于 DNA 合成后的另一组步骤。完整生活史与细胞内过程见病毒与亚病毒因子，整合反应见DNA 重组与转座。

同样的逆转录，几种不同的工作场景¶

HBV：DNA 病毒为什么也需要逆转录¶

乙型肝炎病毒等 hepadnavirus 的病毒颗粒携带 DNA，但复制时先转录出前基因组 RNA（pregenomic RNA），随后在装配中的核衣壳内把它逆转录回 DNA。按颗粒内的基因组把它归为 DNA 病毒，与其生活史中需要 RNA→DNA，并不矛盾。

它的起步方式也与 HIV 不同。病毒聚合酶的 terminal protein 结构域以自身酪氨酸残基提供引发羟基，最初的 DNA 因而与蛋白质共价相连。前面讲过 tRNA 的 3′-OH，这里换成蛋白质上的羟基；判断引发方式，要找到反应实际从哪里开始，而不是看见 RT 就自动补上一条 tRNA。⁵

逆转座：RNA 中间体怎样回到基因组¶

LTR 逆转座元件的若干步骤与逆转录病毒相似：先产生 RNA，再合成 DNA，随后整合到新的基因组位置。酵母 Ty1 甚至会在细胞内形成病毒样颗粒。这组图的上半部分是过表达 Ty1 时观察到的颗粒，下半部分来自冷冻电镜重建，让“病毒样”有了可以直接比较的结构对象。

非 LTR 元件如 LINE，采用的典型办法是靶位点引发逆转录（target-primed reverse transcription）。元件编码的核酸内切活性在靶 DNA 上产生切口，切口的 3′-OH 与元件 RNA 配对，RT 就在这个靶位点开始合成 DNA。引物不必预先作为一条游离短链送来，插入位置本身提供了起步的末端。

group II intron 也把 RNA 与蛋白质组成的复合体用于移动，过程可涉及 RNA 的反向剪接、靶 DNA 切口和逆转录。不同元件的 RNA 结构、引物来源及插入步骤有各自安排，不能把 HIV 的两次链转移图直接拿来当总图。更完整的机制比较见DNA 重组与转座。

端粒酶：模板是酶自己的组成部分¶

端粒酶既没有把完整病毒 RNA 抄成 DNA，也不一定要搬到新的插入位点。它携带一小段内部 RNA 模板，反复延长染色体末端的 G 链。其催化亚基 TERT 属于逆转录酶，模板重定位使同一小段 RNA 可以指导多次重复添加；C 链填补则由另一套装置完成。具体过程见端粒复制与维护。

Retron：细菌会把 RNA 和 DNA 留在同一个分支结构里¶

细菌 retron 编码非编码 RNA 与 RT，可以产生称为 msDNA 的 RNA–DNA 分支结构。这里能够作为引发端的是 RNA 中特定鸟苷的 2′-OH，新 DNA 因而以特别的连接方式连在 RNA 上。逆转录的产物不必总是与 RNA 完全分离的一条 cDNA。

在实验室里，把 RNA 变成可分析的 DNA¶

RT 也是常用实验工具。通过 oligo(dT)、随机引物或特异引物，可以从不同位置开始合成互补 DNA（cDNA），再用于扩增、定量或文库构建。选择引物，就是选择哪些 RNA、哪些区域更容易进入后续分析；RNA 二级结构、完整性以及酶的过程性，也会影响所得 cDNA。

因此，测到某段 cDNA，并不保证原始 RNA 的每个区域都被同样完整、同样高效地复制。具体操作与偏倚见核酸扩增与定量，文库背景见分子克隆与构建设计。

从病毒颗粒中的一条活性曲线，到染色体末端和细菌的 RNA–DNA 分支，逆转录展示的是同一种合成能力怎样被放进不同过程。每遇到一个新系统，重新找一遍模板、引发羟基和新 DNA 的去向，往往就能把陌生的名称拆成可以理解的动作。

参考资料与延伸阅读¶

本页结合 Molecular Biology of the Gene 第 7 版第 12 章与 Weaver 第 5 版第 23 章展开，发现实验和链转移图来自后者。HIV、HBV 和 retron 的进一步证据见相邻脚注。

• Watson JD, Baker TA, Bell SP, et al. Molecular Biology of the Gene. 7th ed. Pearson / Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2014。
• Weaver RF. Molecular Biology. 5th ed. McGraw-Hill; 2012。
• Baltimore D. Viral RNA-dependent DNA polymerase. Nature. 1970;226:1209–1211.
• Temin HM, Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature. 1970;226:1211–1213.
• Hu WS, Hughes SH. HIV-1 Reverse Transcription. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2012;2:a006882.
• Millman A, et al. Bacterial Retrons Function in Anti-Phage Defense. Cell. 2020.