微生物计数与环境检测¶

微生物计数把肉眼不可分辨的细胞、菌落、阳性培养管或噬斑转成数值。不同方法的数值对应不同对象：显微镜记录落入计数室的颗粒，平板培养记录能够在给定培养条件下形成菌落的单位，最可能数法根据一组阳性与阴性培养结果估计低丰度单位，噬斑试验则记录能在指定宿主上完成感染并形成可见噬斑的单位。环境检测还在这些测量之前增加了采样位置、时间、体积和保存过程。写清被测对象和采样单位，结果才具有可以比较的分母。

计数对象与方法边界¶

直接显微计数把观察体积中的细胞样颗粒换算成单位体积的总数。活细胞、死亡细胞和某些碎片可能同时进入结果，细胞团块又可能被算作一个颗粒或多个细胞。流式细胞术同样需要以散射、荧光标记和门控规则定义事件；核酸扩增得到的是目标序列或基因组当量，是否来自完整细胞、活细胞或仍有感染性的病毒，需要额外证据回答。

浊度、干重、细胞氮或总蛋白等指标先测群体生物量，再通过同批材料的校准曲线换算细胞浓度。它们适合连续追踪生长，却会同时受到细胞大小、形状、聚集和胞外物质影响。光密度进入非线性区后，吸光度读数不再与细胞量成比例；应先用相同仪器、光程、培养基和微生物建立工作范围。群体生长测量的生理学背景见微生物生长与控制，哺乳动物与酵母计数室的几何和边界规则见细胞培养、计数与活性检测。

菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）记录能够在规定培养基、温度、气氛和时间内形成可辨菌落的繁殖单位。一个 CFU 可能来自单个细胞、未被分散的细胞团或一段菌丝；受损但可恢复的细胞、活而不可培养细胞以及不适合该培养条件的成员不会形成菌落。因此，CFU 适合描述“在这套条件下可培养的单位”，并不把所有环境微生物简单分成真实的活与死。

最可能数（most probable number，MPN）根据一组已知接种量的培养单元中哪些呈阳性，估计样品的平均浓度。噬斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）则要求病毒在指定宿主、培养基和覆盖层条件下发起生产性感染。CFU、MPN、PFU、颗粒数、基因拷贝数和光密度回答的问题不同，数值之间只能通过同一样品、同一时间的配对实验建立经验关系。

采样设计与样品链¶

环境采样先从监测目的出发。寻找污染源、比较处理前后变化、建立日常基线和验证一次清洁措施，需要不同的点位、时间和重复设计。采样方案应预先写明采样总体、空间位置、采样面积或体积、时间窗口、独立样本数、现场空白、运输空白、阳性过程控制，以及出现异常结果后将采取什么行动。没有明确问题的零散采样，即使培养出许多菌落，也很难说明这些菌落代表了什么。美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的环境采样建议尤其强调，比较组、质量控制和结果处置应在取样前确定。¹

水样使用无菌、密闭且与目标分析相容的容器，避免在取样时触碰瓶口和内盖。经消毒供水中的残余氯或其他氧化性消毒剂可在运输途中继续杀伤细胞，因此需按所用标准加入经验证的中和剂；样品通常避光、冷藏并尽快分析，实际温度和最长保存时间由具体方法规定。取自水龙头的样品还要区分“评价供水主体”与“评价龙头末端”：前者常按标准移除附件、清洁或消毒出水口并充分放流，后者则保留末端装置以反映使用点状态。火焰处理和放流时间须适配出水口材质、龙头类型与采样目标；需要保留末端生物膜时则采用相应的末端采样方案。国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）19458 以采样目的组织饮用水取样、运输和保存，是选择具体步骤时的标准入口。²

池塘、沉积物和浑浊水体通常空间异质性更强。水面、岸边、底层和颗粒附着群落不能用一次随手取样相互代表；应记录水深、位置、温度、天气、浑浊度、采样器和搅动情况。样品从离开现场到完成稀释的时间也是测量链的一部分，因为细胞可能继续生长、死亡、聚集或从颗粒上脱落。未知环境培养物在培养后可能富集原本极少的成员，后续开皿、观察和废弃仍按风险评估与无菌操作、培养与灭菌验证所规定的防护条件进行。

十倍系列稀释与菌落形成单位¶

平板计数要把原样中密集而重叠的繁殖单位稀释到可以分辨的范围。一个十倍系列可将 \(0.5\ \mathrm{mL}\) 样品加入 \(4.5\ \mathrm{mL}\) 无菌稀释液形成 \(10^{-1}\)，充分混匀后换用新的无菌吸液器继续稀释至 \(10^{-4}\)；低浓度自来水样也可从原样开始设置平行平板。实际稀释级数要根据预期浓度、检出限和方法允许的接种量确定。每一级在取样前重新混匀，吸头不接触管壁污染处，不从较高浓度倒退使用同一吸液器，并保留稀释液空白。

涂布平板把小体积样品均匀铺在已凝固、表面适度干燥的琼脂上，菌落主要在表面形成；倾注平板把通常约 \(1\ \mathrm{mL}\) 样品与冷却到方法规定温度的熔化琼脂混合，菌落可在表面和琼脂内部形成。一种本科教学方案使用约 \(15\ \mathrm{mL}\) 培养基、平行倾注平板，并在凝固后倒置培养。倾注法能接种较大体积，却会让细胞短暂接触温热琼脂，深层菌落也常较小；涂布法避免这段热暴露，但接种体积和表面吸收能力有限。培养温度、时间、气氛和培养基必须随目标群体声明，37 ℃培养 24 h 只适用于相应对象和方法。

若第 \(i\) 组平板的菌落数为 \(n_i\)，接种体积为 \(V_i\)，稀释度 \(d_i\) 表示接种液相对原样的浓度分数，则把所有被方法接受的平板合并时，可写成

\(C\) 的单位由 \(V_i\) 决定，水样通常报告为 CFU/mL。只使用一个稀释度、各平板体积相同时，公式化为 \(C=\bar n/(Vd)\)。例如，\(10^{-3}\) 稀释液的两个 \(1\ \mathrm{mL}\) 平板各有 46 和 54 个菌落，则平均数为 50，结果为 \(5.0\times10^4\ \mathrm{CFU/mL}\)。原始平板数、稀释度和接种体积仍应与换算结果一同保存。

“可计数范围”是经过具体方法验证的操作范围，30–300 CFU/平板是常见经验范围之一。美国不同标准曾使用 25–250、30–300 等区间，而 FDA 现行《细菌学分析手册》（Bacteriological Analytical Manual，BAM）的食品好氧平板计数方法采用 15–300 CFU/平板，并用基于泊松分布的最大似然方法合并合格平板和稀释度。³ 计数接受范围与相邻稀释度的合并规则均应来自所采用的方法。相邻十倍稀释的计数若明显不符合稀释关系，应检查混匀、移液、菌团、蔓延菌落和记录错误，再按该标准的合并、估计或作废规则处理。

菌落过密、互相融合或被蔓延生长覆盖时，结果写作不可计数或超过方法上限，并优先读取更高稀释度。全部平板都低于已验证范围时，可以按方法标作估计值，而不能用“挑最接近范围者”掩盖较大的抽样误差。全部平板无菌落也不等于样品绝对无微生物：若整套平板合计相当于 \(E\ \mathrm{mL}\) 原样，零菌落的操作性检出边界约为小于 \(1/E\ \mathrm{CFU/mL}\)；在独立泊松抽样近似下，95% 置信上界约为 \(3/E\)。报告应说明培养条件以及这个边界的算法。

直接计数、浊度与培养计数¶

血球计数板或 Petroff–Hausser 计数室给出已知网格面积和腔深，计数体积等于所选网格面积乘以腔深。样品稀释、计数格选择、边界纳入规则和团块处理必须在实验前固定；多个大格和独立装片之间的离散程度能揭示沉降、蒸发或混匀不充分。荧光核酸染色可提高低对比样品的可见性，膜不透性染料、酯酶底物或膜电位探针分别反映特定细胞性质，不能仅凭“染上或未染上”就给出跨物种通用的活死判决。

光密度适合高频、非破坏性跟踪同一培养过程，平板计数适合估计可繁殖单位，直接计数能发现培养法遗漏的颗粒。把三者在对数生长期、稳定期和处理后时间点并行测量，可以区分细胞总数增加、单细胞散射改变与可培养性下降。霉菌、放线菌或易成团细菌以单细胞为计数单位往往缺乏稳定意义，干重、菌丝长度、蛋白量或经声明的 CFU 条件可能更合适。严格厌氧菌的滚管、深层半固体培养或厌氧工作站计数仍是 CFU 方法，只是把氧化还原环境纳入“能够形成菌落”的定义。

最可能数估计¶

当目标单位很少、样品含有妨碍平板分离的颗粒，或培养读出更适合用“有／无”表示时，可采用多管发酵或其他 MPN 设计。若样品中的可检出单位以平均浓度 \(\lambda\) 随机、独立地进入体积为 \(v\) 的培养管，并且至少一个单位就足以产生阳性读出，则泊松模型给出

实验在多个体积或连续稀释度设置若干平行管，培养后记录每组阳性管数。MPN 是使这一整组阳性—阴性组合最可能出现的 \(\lambda\)，置信区间则表示有限管数带来的统计不确定度。这个估计依赖单位随机分布、各管近似独立、团块效应可接受以及培养体系能把目标单位可靠转成阳性信号；抑制物、交叉污染和读数误判都会破坏模型假设。FDA BAM Appendix 2 给出了不同三管、五管和十管设计的现行表格与计算方法。⁴

一种三管设计在原样、\(10^{-1}\) 和 \(10^{-2}\) 三组各接种三管，等效接种量分别为 1、0.1 和 \(0.01\ \mathrm{mL}\)，结果换算为每 100 mL 或每 100 g。只有在这一设计和单位完全一致时，诸如 1-1-1 对应 110 MPN/100 mL、95% 置信区间约 10–230 的查表结果才成立。换用五管、不同体积或不同稀释间隔就需要匹配的表或似然计算。全阴性通常只能报告低于某一上限，全阳性通常只能报告高于某一下限；增加平行管和覆盖合适的阳性比例，才会缩窄区间。极不符合浓度梯度的组合还应触发对抑制、移液和污染的调查。

大肠菌群与 E. coli 的操作性检测链¶

经典多管发酵法以乳糖发酵产生酸和气体作为大肠菌群的初步读出。选择—鉴别培养液可含乳糖、胆盐和溴甲酚紫，并用倒置 Durham 小管收集气体；原样及 \(10^{-1}\)、\(10^{-2}\) 稀释各接种三管，培养后以颜色和气体记录推定阳性。胆盐提高对部分非目标微生物的选择压力，溴甲酚紫记录 pH 变化，Durham 管记录累积气体，但三者共同出现仍是操作性筛查结果，不是物种身份证明。

FDA BAM 的经典食品检验链把推定阳性管转入亮绿乳糖胆盐培养液或相应确证体系，再从阳性培养物划线至 Levine 伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar，EMB）等选择鉴别平板；有典型菌落者还需纯化、革兰染色和吲哚、甲基红、Voges–Proskauer 与柠檬酸盐利用（IMViC）或经验证的鉴定试验。⁵ EMB 上强烈乳糖发酵菌可呈深色甚至金属光泽，其他大肠菌群可呈紫黑、紫红或黏液样菌落，而非目标菌也可能产生相似外观。经典确证路径以典型菌落、革兰阴性无芽孢杆菌和重复发酵等结果共同建立证据，单一菌落颜色不足以确定为 Escherichia coli。

总大肠菌群包含环境中能够满足该方法定义的多类细菌，对粪便污染的专一性有限；E. coli 是更具粪便来源意义的指示菌，其阴性结果仍须与病毒、原生生物及其他病原体的独立风险评估结合。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）饮用水指南把 100 mL 中检不出 E. coli 或耐热大肠菌群作为饮用水微生物质量的核心目标；池塘生态调查具有不同的评价目的。⁶ 培养基、孵育温度与时间、样品保存、受损细胞恢复以及确证规则均按所选标准报告。

膜过滤与低浓度水样¶

膜过滤法让已知体积水样通过具有规定孔径的无菌滤膜，再把滤膜贴在选择性或鉴别培养基上培养。水质微生物学常用标称孔径 \(0.45\ \mathrm{\mu m}\)、直径 47 mm 的膜截留细菌，把低浓度水样中的单位集中到一张可培养表面。滤膜应无气泡地贴合培养基，过滤装置在样品间维持无菌，漏斗和稀释水设置空白控制；阳性、阴性参考培养物用来核对培养基的恢复和选择能力。

若滤过体积为 \(V\ \mathrm{mL}\)，目标菌落数为 \(N\)，则

给出每 100 mL 的目标 CFU。过滤 100 mL 后出现 12 个经方法确认的目标菌落，即报告 12 CFU/100 mL；若没有菌落，结果应写作在该方法和 100 mL 分析体积下未检出，而非“绝对为零”。美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency，EPA）第 1604 号方法展示了用酶底物 MI 培养基同时枚举总大肠菌群和 E. coli 的一套完整膜过滤实例，包括培养基空白、过滤空白、阳性与阴性培养控制。⁷

高浑浊度、藻类或悬浮颗粒会堵塞滤膜、遮蔽菌落并增加背景蔓延。可以按方法减小过滤体积、过滤多个稀释样或改用适合颗粒样品的 MPN 设计，但结果的分母和检出限必须随之重算。滤膜孔径是名义规格，不意味着所有目标细胞都以同样效率截留、存活和复苏；过滤压力、膜材质、培养基、消毒损伤和竞争菌群都会影响回收率。

空气与表面采样¶

沉降平板依靠重力让空气颗粒落到培养基表面，结果可写成给定平板面积和暴露时间内的 CFU。它容易操作，适合在固定条件下比较沉降趋势，却没有测量通过平板上方的空气体积，对粒径、气流、人员活动和沉降速度高度偏倚，尤其不能把 CFU/平板直接换算为可靠的 CFU/m³。主动空气采样器用撞击、液体捕集或过滤处理已知空气体积，才具备按空气体积报告的分母；采样流量、时间、培养基、撞击孔多重命中校正和仪器校准共同决定回收率。

表面可用接触平板、拭子或海绵采样。规则平整表面可定义接触面积，凹槽、器械连接处和较大不规则区域通常更适合经润湿的拭子或海绵。若表面刚使用消毒剂，采样介质需要与残留药剂相容的中和剂，否则消毒剂会在离开现场后继续降低回收数。结果报告为 CFU/cm²、CFU/规定面积或 CFU/件，并记录实际覆盖面积、擦拭方向、回收液体积和培养条件。培养无生长仅表示在该面积、回收效率和检出限下未检出可培养单位，不能据此宣称表面无菌。

空气和表面微生物本来就会随季节、通风、湿度和活动水平波动。日常环境监测更重视固定方法形成的基线、趋势和异常调查，而不是为所有场所设一个脱离用途的“菌落总数合格线”。医疗、食品、制药、饮用水和普通教学环境分别受不同规范约束，阈值必须连同场景、采样器和行动方案引用。

双层平板与噬斑形成单位¶

双层琼脂覆盖法把稀释后的噬菌体与处于适宜生理状态的敏感宿主混合，再加入温度合适的软琼脂覆盖层并铺到基础琼脂平板上。覆盖层限制噬菌体和宿主细胞的远距离扩散：一个感染性单位在局部完成吸附、复制、裂解和邻近传播后，形成相对清亮或混浊的噬斑。宿主菌株、菌龄和密度，二价离子、吸附条件、覆盖层琼脂浓度和厚度、培养温度与时间都会改变噬斑形成效率和外观。经典双层平板法的历史与这些条件效应可参见 Kropinski 等的方法综述。⁸

若第 \(i\) 个可接受平板有 \(p_i\) 个噬斑，接种噬菌体液体积为 \(V_i\)，稀释度为 \(d_i\)，则滴度同样可写为

通常报告为 PFU/mL。每批至少包括没有噬菌体的宿主菌苔对照，以确认宿主能够连续生长且没有自发空斑；经验证的参考噬菌体可监测宿主敏感性和覆盖层批次。点滴试验适合快速筛查裂解活性或选择后续稀释范围，但高浓度裂解、从外裂解和扩散重叠会妨碍逐斑计数，不能未经验证就把点滴区的清亮程度换算成 PFU。

PFU 是条件性的感染性单位，并非成熟病毒颗粒总数。多个聚集颗粒可能只形成一个噬斑，一个物理完整的颗粒也可能因宿主不敏感、吸附失败或培养条件不合适而不形成噬斑；噬斑还可能由宿主抑制、细菌素或其他非噬菌体因素模拟。电子显微镜、流式颗粒计数和定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分别偏向物理颗粒或核酸拷贝，只有与噬斑法并行时，才可估计颗粒—感染性比值。一步生长曲线按时间重复测定游离和总感染性单位，可估计潜伏期和平均释放量，但这些参数仍属于指定宿主与实验条件下的表型，机制背景见病毒与亚病毒因子。

质量控制、不确定度与报告¶

计数误差来自连续的四层过程。采样层决定样品是否代表目标环境；稀释和接种层引入体积、混匀与转移误差；培养层决定目标单位能否恢复和表达读出；识别与计数层则受菌落重叠、主观分类和记录规则影响。技术平行重复主要估计同一样品的分析变异，独立时间、位置或培养批次才能反映生物与环境变异。两类重复不能用一个笼统的“\(n\)”相互替代。

在理想随机分布下，菌落和噬斑数近似服从泊松分布，计数为 \(N\) 时相对抽样标准差约为 \(1/\sqrt N\)；低计数因此天然具有较大的相对不确定度。真实样品中的团聚、空间异质性和批次效应常使方差进一步增大。MPN 已把有限阳性管造成的不确定度表现为置信区间；平板和膜过滤结果也应在重要比较中给出区间、方法检出限或定量限。ISO 19036 为食品链定量微生物学测量不确定度提供了实验估计框架，其原则同样说明不确定度必须连同方法和对象定义。⁹

完整结果至少包括样品编号、采样位置和时间、采样面积或体积、保存与分析时间、稀释液和培养基、培养温度／气氛／时间、接种或过滤体积、所有原始平板或管结果、接受与排除理由、计算公式、单位、检出限、估计值或上下界、质量控制表现和异常。若采用选择性培养基，还应说明目标菌落如何确证；若比较多个时间点，应保持计数对象、采样器和报告分母一致。这样的记录使“未检出”“数量下降”和“方法没有回收到目标”成为可以区分的结论，也使经典计数方法能与现代分子和单细胞技术在同一证据链中互相校准。

参考资料与延伸阅读¶