无菌操作、培养与灭菌验证¶

微生物培养把原本看不见的少量细胞扩增成可观察、可测量的群体，也同时放大了污染、暴露和误判的后果。无菌操作因而包含三个互相关联的目标：保护培养物免受外来微生物污染，保护操作者免受培养物和气溶胶暴露，并阻止培养物逸散到工作环境。采用哪一种容器、操作空间和去污程序，必须先知道菌株身份、培养目的、可能产生的气溶胶以及培养后的处置路径；美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）和美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）的实验室生物安全框架也把逐项实验方案的风险评估置于控制措施选择的中心。¹

这些环节之间的实验逻辑用于理解和审查具体方案；实际操作以菌株说明书、设备验证文件、机构生物安全规定和经过批准的标准操作程序（standard operating procedure，SOP）为准。

从菌种、目的与风险选择培养系统¶

培养系统的选择始于材料身份。教学和常规实验应使用来源清楚、获准使用并可追溯到菌株号或保藏记录的培养物；收到菌种后，要把标签、来源、传代历史、预期形态和储存条件与随附资料核对。来源不明的环境分离物在鉴定前可能具有未知危险，不能仅因来自日常环境就按最低风险材料处理。美国微生物学会（American Society for Microbiology，ASM）的教学实验室指南尤其要求逐个练习进行风险评估，并建议先用低风险已知菌株训练新的操作技术。²

培养基要同时匹配微生物的营养需求和实验目的。按成分可分为天然、合成和半合成培养基，按物理状态可分为液体、固体和半固体培养基，按用途还可分为基础、富集、选择、鉴别、运输和保藏培养基。碳源、氮源、无机盐、生长因子、水活度、渗透压、pH、氧化还原状态和凝固剂都会改变可生长的对象及其表型；所谓“通用培养基”只是在限定对象中的经验选择。选择性培养得到的优势菌也不自动等于目标菌，鉴别反应则需要阳性、阴性和未接种对照才能解释。相关生理基础可与微生物营养与代谢及微生物生长与控制对照阅读。

同一批培养通常至少包括未接种培养基，用于检验培养基和操作过程的无菌性；在需要证明培养条件确实支持目标生物时，还要设置适当的生长阳性对照。样品和对照应经历可比较的培养、观察与记录过程。培养结束后的菌落外观、浑浊或代谢颜色只能说明出现了相应表型，不能单独完成菌种鉴定。

无菌操作的控制边界¶

开始操作前先划分清洁区、操作区和污染物暂存区，移走与当前实验无关的物品，再准备好标签、培养容器、无菌工具和废物容器。台面处理所用消毒剂须与材料、目标微生物和表面相容，并达到经验证的浓度与接触时间；有机物残留会显著降低许多消毒剂的效力。手套不能代替手卫生，也不能带着污染跨越键盘、门把手、记录本和洁净耗材。

开放台面、Ⅱ级生物安全柜、洁净工作台和化学通风橱提供的保护不同。开放台面只适用于风险评估允许且不易产生气溶胶的操作；Ⅱ级生物安全柜通过定向气流和高效过滤同时兼顾人员、环境与样品保护；洁净工作台主要保护样品，其气流可能把生物材料吹向操作者；化学通风橱用于控制有害蒸气，并非微生物培养的默认无菌空间。进入生物安全柜的物品应按清洁到污染的方向排列，不遮挡前后格栅，并让动作缓慢而稳定。

传统教材常把火焰周围数厘米描述成“无菌区”，但热羽流不能建立有明确边界且可验证的无菌空间。明火还可能扰乱生物安全柜气流，引燃乙醇或损伤过滤系统，因此生物安全柜内通常采用一次性无菌接种器或经批准的电热灭菌装置。紫外照射的效果受距离、阴影、灯管老化和表面洁净度影响，不能替代擦拭消毒、设备维护和培养结果质控。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的实验室生物安全资料将火焰和紫外照射置于风险评估及经验证的去污程序中。⁴

斜面与液体培养的传统转接¶

斜面转接仍是训练手、眼和无菌边界协调的重要路径。先在试管而非管塞上标明菌株、培养基、日期、传代或样品号和操作者，并检查培养基有无干裂、异常颜色、浑浊或既存菌落。把待用试管置于容易连续操作的位置，预先旋松管盖，但在真正转接前仍保持关闭。

使用可重复灭菌的接种环时，要使环丝和邻近柄部达到规定的灭菌状态，并在无菌培养基区域或经批准的冷却位置充分冷却；炽热的接种环既会杀死接种物，也可能使液滴骤然沸腾而形成气溶胶。取菌量以足以完成接种为限。操作中用同一只手控制管盖，不把管盖放在台面上；管口开放时间尽量短，工具不碰触管缘、手指或台面。接种斜面时，接种环从斜面下部向上轻划而不刮破琼脂；接种液体时避免用力拍打、吹泡和快速弹动。随后立即合上容器，将使用过的工具按批准程序再灭菌或投入相应废物容器，并记录接种关系。

开放台面转接有时包括短暂灼烧试管口。这项动作只在机构允许明火、容器材质相容且风险评估认可时采用；它不能补救长时间敞口、管盖落地或接种环触碰非无菌表面。无论是否使用火焰，真正可控制的变量始终是暴露时间、操作路径、工具状态、容器开口方向和结果对照。

平板制备、划线与培养¶

固体培养基按配方和设备程序溶解、灭菌并冷却到适宜的倾注状态。分次微波加热和每皿约 15 mL 的用量适用于特定容器、培养基与教学规模，具体参数须随设备和配方确定；微波加热可能出现暴沸和温度不均，含热敏成分的培养基还需在基础培养基冷却到规定范围后无菌加入。倾注时只把皿盖掀开到足以完成操作的程度，不把皿盖内面放在台面上。凝固后的平板应检查厚度、表面水分、气泡、裂纹和未接种对照。

分区划线的目标是逐区降低细胞密度，使后续区域出现来自单个细胞或细胞团的分离菌落。第一分区带入原始接种物；随后按方案在各分区间重新灭菌并冷却接种环，或更换无菌工具，只从上一分区边缘少量带菌进入下一分区。直线是否完全平行、平皿是否旋转约 30°都不是成功标准；关键是稀释梯度连续、划痕不过度重叠且不割破琼脂。划线结束后及时闭合平皿，并在皿底记录样品信息，避免皿盖互换导致身份丢失。

培养时是否倒置，要结合平板类型和装置要求判断；常规琼脂平板倒置培养有助于减少冷凝水滴落造成的菌落扩散。温度、时间、光照和气体环境均由菌株说明书、实验目的及经验证的方案决定，37 ℃培养 24 h 只适用于相应菌株和方案。美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）的培养指南同样要求按具体菌株推荐的培养基与气氛复苏和传代。³ 培养后若出现预期之外的生长、颜色、气味或容器异常，应保持容器闭合并按偏差和生物安全程序处理，不在开放台面上反复嗅闻或挑取未知菌落。

氧需求与厌氧培养¶

微生物对氧的响应通常以生长是否需要氧、能否在有氧和无氧间转换，以及对低浓度氧的偏好来描述。专性需氧、兼性厌氧、微需氧、耐氧厌氧和专性厌氧等类别反映的是整体生长表型；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等防御系统参与耐受，但单个酶的有无不足以定义全部类别。

液体培养中的供氧由容器形状、装液量、液面面积、振荡轨迹与转速、黏度、通气和顶部空间共同决定。相同转速在不同摇床、挡板瓶和装液体积中并不代表相同的氧传递。需要限制氧时，可以使用深层或含还原剂的培养基、预还原厌氧灭菌培养基、密闭厌氧罐、气体置换系统或厌氧工作站；Hungate 滚管法则把预还原培养基、无氧气相和管壁琼脂培养结合起来，是经典严格厌氧分离方法的一部分。⁵

厌氧培养的控制必须覆盖转接和孵育全过程，仅把接种后的平板放入厌氧罐还不足以证明接种物未暴露于氧。培养系统应使用适配的氧化还原指示物或其他经验证的环境检查，并设置能够揭示培养基失效、罐体漏气和接种物失活的对照。气体钢瓶、真空、可燃氢气和催化装置各有独立的工程与消防要求，不能从一个通用气体比例推导所有设备的安全操作。

培养基灭菌与热损伤¶

清洁是去除污物，消毒是把特定对象上的微生物负荷降到规定水平，灭菌则要求使可繁殖微生物达到预先规定的失活目标。湿热灭菌依靠饱和蒸汽直接接触负载并传热；压力的作用是使蒸汽达到高于常压沸点的温度，并不是压力本身完成灭菌。有效循环取决于灭菌器型式、空气排除、负载材质、容器大小、液体体积、装载密度、包装、初始温度以及最难到达位置的时间—温度历程。CDC 对蒸汽灭菌的说明也把蒸汽、压力、温度和时间列为共同条件，并强调空气排除与过程监测。⁶

121 ℃、15—20 min 的湿热处理和 160 ℃干热 1—2 h 都是教学中常见的参考条件，具体负载仍须依据已验证循环放行。计时起点应以设备和负载验证所定义的暴露阶段为准，而不是从按下启动键或腔体显示到达温度时任意起算。液体容器要留出膨胀空间并使用允许压力平衡的封闭方式；过度装载、紧密堆叠和不恰当包装会阻碍空气排出与蒸汽穿透。液体循环、器械循环和废物循环的热惯性、排气与冷却风险不同，不应混装后沿用同一参数。

培养基本身也会在受热时改变。还原糖与含氨基化合物可能发生褐变反应，磷酸盐和金属离子可能沉淀，维生素、抗生素和其他热敏组分可能降解，pH 与凝胶性能也会漂移。因此基础培养基、糖或磷酸盐溶液和热敏添加物有时需要分开处理，再以无菌方式合并。膜过滤适于部分热敏溶液，但它是依靠孔径和材料特性去除颗粒或微生物的过程；滤膜完整性、吸附损失、溶液黏度和目标生物大小均须验证，不能笼统宣称过滤可以去除所有病毒或使任何溶液“绝对无菌”。

灭菌循环的确认、验证与放行¶

灭菌程序建立时要用最不利负载证明腔体分布、空气排除和负载内部穿透能够达到预定失活目标；日常运行随后用物理、化学和生物监测确认已验证状态仍然受控。温度、压力、时间和循环打印记录属于物理监测。外部化学指示物主要显示物品经过了某种处理，内部多参数指示物反映包装内部接触到的条件；颜色改变并不证明物品已经无菌，也不能代替生物指示物。CDC 的灭菌实践明确要求机械、化学和生物监测结合，并把生物指示物视为直接监测过程杀灭能力的方法。⁷

蒸汽过程常使用含嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）高抗性芽孢的生物指示物。指示物要放在经验证最难灭菌的位置，并同时设置未处理阳性对照、培养条件和规定读数时间。生物指示物无生长支持的是“这一挑战位置在该循环中通过”，不能证明负载中每一件物品都无菌；阳性结果则是质量事件，相关负载应隔离而不能使用或处置，随后检查循环记录、装载、指示物、设备状态和培养步骤。只有按机构程序完成调查、必要的维修或再确认并获得可接受结果后，设备才能恢复相应用途。

监测频率由用途、负载风险、法规和机构程序共同规定。CDC 2026 年针对生物危害废物高压灭菌器的考虑文件建议定期使用生物指示物，并把至少每月及维修后测试作为美国实验室的一项实践建议；它不是所有国家、设备和负载的统一法定周期。⁸ 预真空设备的空气排除试验、校准和预防性维护也必须按设备说明与机构程序执行。

废物、去污与批次记录¶

废物从产生位置就应按液体、可高压灭菌固体、锐器和含化学或放射性成分的混合废物分流，置入相容、耐受后续处理且有生物危害标识的容器。运输至去污设备前保持二次容纳和可追溯标签，避免把密闭容器、锐器盒或高液面容器直接照搬进并不适配的循环。高压灭菌能处理经验证的生物负荷，却不能消除化学毒性、挥发性物质或放射性；混合废物须按机构的专门路线处理。WHO 的去污和废物管理资料强调从产生、分流、容纳到最终处置的完整链条，并要求方法由风险评估和验证支持。⁴

一份能够复核的培养记录至少关联菌株或样品 ID、培养基名称与批号、关键配制条件、灭菌批次、接种来源与去向、操作者、培养设备与条件、未接种和阳性对照、观察结果、处置方式以及任何偏差。灭菌记录还应保存负载类别与装载图、循环编号、物理记录、化学和生物指示物结果、放行人及故障处置。这样才能在污染、无生长或灭菌失败时沿着同一证据链定位原因，而不是只靠回忆重做实验。

故障定位与结果判读¶

未接种对照出现生长时，应依次检查培养基配制与灭菌、容器完整性、倾注和转接环境、工具处理及培养设备中的交叉污染；在原因澄清前，同批样品结果不能按正常批次解释。目标培养物不生长则可能来自接种物失活、培养基不适配、抑制性热降解产物、温度或 pH 不当、氧暴露或气氛失效。此时阳性生长对照能帮助区分“系统不支持生长”与“样品本身没有活菌”。

平板第一分区密集而后区出现分离菌落，说明逐区稀释达到目的；整板融合通常提示接种量过大、区间带菌过多、环未冷却或平板表面过湿。划线过深造成的沟槽、冷凝水形成的流痕和菌落沿划线机械拖带都可能制造貌似特殊的形态。出现异色、混合形态或非预期菌落时，先把它记录为待调查的培养偏差；是否开皿、纯化或鉴定，要在重新评估风险和确定后续容纳条件后决定。

参考资料与延伸阅读¶