显微观察与标本制备¶

显微镜把样品与光或电子的相互作用转换成可观察、可记录的图像。图像由样品状态和成像系统共同形成：可见细节取决于样品怎样被固定、切薄、染色或标记，也取决于照明方式、物镜数值孔径、焦平面、探测器采样和后续处理。学习显微技术因此要沿着“制样—照明—成像—校准—记录—解释”整条链工作，才能判断图中的亮暗、颜色、边缘和颗粒分别对应什么结构。

显微观察从教学实验常见的复式光学显微镜出发，沿低倍定位、高倍观察、测微、临时装片、离析、压片、涂片和生物绘图形成完整训练路径，再把相差、微分干涉、荧光、共焦和电子显微镜放入同一证据框架。具体仪器的机械限位、光源、清洁剂和操作方向必须遵守当前型号说明书；刀片、固定剂、染液和离析液的使用还须经过实验安全、伦理与风险管理所述的风险评估。

样品平面与观察图像¶

手持放大镜以单一透镜形成放大的虚像，是单式显微装置的典型例子。现代体视显微镜常用于昆虫、器官表面和解剖操作，具有低倍、较大视野和较长工作距离，通常包含两条成像光路，结构上不同于单透镜放大镜。复式光学显微镜则由物镜和管镜／目镜等多组元件组成：物镜首先收集样品发出的或透过样品的光并形成中间像，目镜再把中间像呈现给眼睛；相机端口把相应像面采样为数字图像。有限筒长与无限远校正系统的具体光路不同，物镜、管镜和目镜需要在其设计系统内配套使用。¹

透射明场显微镜中，光源、集光镜、视场光阑、聚光器、样品和物镜共同形成照明与成像链。聚光器把具有一定角度范围的光送入样品，物镜收集经样品调制的光；视场光阑限定被照亮的范围，聚光器孔径光阑则改变照明锥角、工作数值孔径、对比度和景深。把聚光器升降或把孔径光阑开到最大仅仅为了“更亮”，会牺牲照明均匀性或对比度；照明强度应主要用光源控制或中性密度衰减调节。

Köhler 照明把光源像与样品像安排在两组不同的共轭平面，使样品获得均匀照明，同时允许视场光阑和孔径光阑分别控制照明范围与角度。具备相应部件的显微镜通常先聚焦样品，再缩小视场光阑，以聚光器高度把光阑边缘调清、居中后开到刚好越出视野；孔径光阑再依据物镜和所需对比度设置。具体旋钮、可调项目和次序随机型而变，没有这些部件的教学镜也不应强行套用同一流程。²

放大、分辨与数值孔径¶

放大倍数说明像相对于对象被放大多少，分辨则说明相邻细节能否被区分。继续提高目镜倍数或把数字图像放大，只会把已有衍射斑和像素铺得更大；没有新增空间信息的放大称为空放大。数字图像最终显示大小还会随屏幕、排版和缩放改变，因此科研图像应给出经校准的比例尺，而不能只写“物镜 40×”来代替尺度。³

物镜的数值孔径（numerical aperture，NA）为

其中 \(n\) 是样品与物镜前透镜之间介质的折射率，\(\alpha\) 是物镜能够接收的最大光锥半角。NA 同时影响集光能力、横向分辨和轴向景深。对衍射受限的常规光镜，横向分辨距离常依判据近似写成 \(d\approx 0.61\lambda/\mathrm{NA}\) 或 \(d\approx\lambda/(2\mathrm{NA})\)；这些式子说明较短波长和较高 NA 有利于区分近邻点，却不是对任何照明、标本和处理算法都成立的固定实测值。聚光器孔径、像差、折射率失配、盖玻片厚度、信噪比和采样也会降低实际表现，不能用“物镜 NA 与聚光器 NA 的平均值”替代系统评估。⁴

物镜筒上的 40×/0.65 通常依次表示标称放大倍数与数值孔径；还可能标出 Oil、Water、盖玻片厚度、校正等级、相差环和校正环等信息。工作距离是物镜在焦点处前透镜与盖玻片或样品表面之间的间隙，通常随 NA 和放大倍数上升而缩短。景深也通常随 NA 增大而变浅，所以高倍观察对切片厚度、盖玻片平整和细调焦更敏感。平场、色差和球差校正等级改善像场或不同波长的重合，但不应仅凭 Plan、Fluor 或 Apo 名称推断某一具体物镜适合所有样品。¹

低倍定位与高倍观察¶

开始前先确认显微镜类型、物镜标识、光路和移动部件，检查玻片是否破裂、盖玻片是否朝向物镜以及样品是否位于物镜工作距离内。便携式教学镜按说明书用双手支承镜臂和镜座搬动；大型倒置、共焦或电镜系统由专人移动。打开光源时先用较低强度，选择最低倍干式物镜，将样品固定在载物台并把目标置于光路中央。

调焦动作要根据仪器究竟移动载物台、物镜还是镜筒来判断。存在碰撞风险时，从侧面观察物镜与玻片的相对位置，再沿说明书规定方向接近安全起始位置；从目镜观察时，使物镜与玻片逐渐远离碰撞方向直至出现像。低倍下用粗调找到样品平面，再用细调取得清晰像并建立 Köhler 照明。“镜筒先降到距玻片 5 mm，再反向升起”适用于部分旧式机械结构，现代正置和倒置显微镜则应依各自说明书确定起始位置和调焦方向。

在低倍视野中找到并居中目标后再换高倍物镜。许多物镜具有近似齐焦设计，但更换物镜后仍可能需要少量细调；高 NA 物镜工作距离很短，除非型号说明明确允许，不应在观察高倍像时大幅使用粗调，也不能强扭已经到达限位的旋钮。双目镜应调好瞳距和屈光度并用双眼自然观察，“左眼窥镜、右眼作图”可以作为单目镜时代的训练姿势，却不应压过双目系统降低疲劳的正确设置。

油浸只用于标明相应浸液的物镜，并使用与物镜设计相符、状态合格的浸液。先在干式低倍下定位，再移开干式物镜、加入少量浸液并缓慢转入浸液物镜，避免气泡和油污染邻近干式物镜。现代浸液还包括水、甘油和硅油；历史上使用的香柏油会老化并改变性质，不能代替厂家规定的浸液。观察结束后及时按当前型号说明书清洁物镜和可能接触浸液的聚光器表面。⁵

视野尺度与测微校准¶

目镜分划板或电子叠加刻度本身只有任意格数，必须用具有已知刻度的镜台测微尺建立当前光路下的长度关系。若镜台测微尺每格实际长度为 \(l_s\)，视野中 \(N_s\) 格镜台刻度与 \(N_o\) 格目镜刻度重合，则当前配置下

其中 \(l_o\) 是一格目镜刻度代表的样品长度。测得对象跨越 \(N\) 格时，长度为 \(Nl_o\)。例如“全长 1 mm、分 100 格”的镜台尺每格为 0.01 mm，即 10 µm；实际使用应读取该测微尺刻字或证书，因为不同产品可以采用不同分度。⁶

物镜、变倍器、相机适配镜、分辨率设置或裁切方式改变后，标定关系可能改变，因此每一套实际配置要分别校准并保存记录。相机图像还需把像素尺寸映射到样品平面；比例尺必须由这项空间标定生成并与图像一同缩放，不能在导出后凭视觉估算。接近衍射极限的对象即使可被检测，也可能不能可靠地量出真实直径；采样太稀会产生混叠，采样更密则只改善数字表示，不会突破光学分辨极限。长度、面积和计数的校准状态应与测量、溶液配制与仪器校准中的溯源、验证和不确定度原则一致。

历史教学镜可在目镜光阑面安装指针以共同指认目标，现代系统通常使用厂家配套分划板、显示叠加或软件注释。自行拆开目镜并粘入头发会带入灰尘、改变像面并可能损坏涂层；只有可维护的旧式目镜和经批准的教学方案才应由受训人员安装专用指针。

对比形成方式与可见信息¶

透明样品常吸收很少，是否“看见”取决于仪器把相位、偏振或特异标记转换成强度差异的方式。每种模式都突出一部分性质，也产生自身伪影；比较图像时需要结合成像原理和研究对象，而非只按清晰程度排序。⁷

标本制备的共同逻辑¶

制样的首要任务是让感兴趣结构进入可成像的厚度、方向和对比条件，同时尽量限制处理造成的改变。活体或新鲜临时装片保留动态和水合状态，却可能受到缺氧、蒸发、温度、渗透压和盖玻片压力影响；固定样品便于保存、切片和重复定位，但交联、沉淀、脱水与抽提会改变体积、膜和分子可及性。切片能减少重叠和离焦背景，也把三维结构变成一个有方向的二维截面。⁸

组织学石蜡制片的一般链条包括取材与方位记录、固定、脱水、透明、浸透与包埋、切片、展片与载片、复水或相应预处理、染色和封片；树脂、冰冻切片、振动切片和电子显微制样使用不同介质与条件。每一步都要围绕目标结构、后续染色或标记及所需厚度选择。固定太慢会出现自溶，过度固定可能掩蔽抗原；脱水和透明可抽提出脂质并造成收缩；包埋方向错误会让目标层面永远不进入切片。更详细的组织固定、标记和成像质控由组织学染色与细胞成像承接。

染色和荧光标记提供对比或分子身份，但信号同时取决于试剂可达性、亲和力、反应条件、样品厚度和背景。阴性对照、阳性对照、二抗对照、竞争或遗传对照应按问题选择。观察到某区域“染得深”可以描述当前方法的读出，若没有校准和线性范围，不能直接推成该物质的绝对含量。

装片、离析、压片与涂片¶

经典玻片制作方法各自回答不同的形态问题。教学中保留这些方法的逐步练习，能把样品厚度、方向、细胞分散程度和机械作用与最终视野直接联系起来。

制作水装片时，载玻片和盖玻片应洁净、与样品相容。先在液滴中安排材料方位，再使盖玻片一边接触液面并缓慢放下，常可减少空气被困；液体过多会使材料漂移，过少会造成干涸和折射率不均，可从盖片边缘加液或用吸液材料受控调节。气泡、原有细胞间隙和脂滴在显微镜下可能相似，不能只靠“从侧面滴水把气泡赶走”判断或修复。

离析液、水解液和固定离析液必须按材料和后续读出验证。铬酸—硝酸、浓盐酸—高浓度乙醇等传统配方具有强腐蚀性、氧化性或毒理风险；教学时可保留“选择性削弱组织连接以观察单细胞”的技术目的，具体试剂与条件由实验室风险评估确定。压片应在防护和承托条件下使用受控、均匀的工具或方法，减少玻璃破裂、飞溅和样品横向剪切。涂片则要预先定义需要的细胞密度与可接受区，并以预定取样规则代表整张玻片。

生物绘图与观察记录¶

生物绘图是一种主动观察训练。绘图者需要持续比较轮廓、比例、层次、相邻关系和变异，从而辨明预期结构与实际可见结构之间的差距。它与显微照片承担不同任务：照片保存仪器采样的视野，绘图明确观察者如何选择和解释结构；严谨记录可以同时保留二者。

绘图前先在低倍确定对象、截面方向和布局，再在高倍逐区核对。传统铅笔图以清楚、连续的单线表示边界，用大小一致的点及疏密变化表示需要记录的明暗，不用反复涂抹制造艺术性阴影。标注线应整齐、尽量不相交，文字写明结构名称；图题同时记录材料、部位、制片或染色方法、观察方向、日期和物镜。若把多个焦层或多个个体的特征合成一图，要明确标为解释性合成，不能让读者误以为它来自单一视野。

“近大远小”和立体明暗只在观察对象确有空间表面且绘图目的需要时使用，二维切片不能凭想象补成立体器官。旧式报告常只注明总放大倍数，现代记录还应通过测微校准加入比例尺或关键尺寸。绘图允许简化无关噪声，却不能删除与结论不一致的真实结构；对于计数、面积、灰度和形态统计，应回到原始图像和预先定义的取样规则，而不是在理想化绘图上测量。

伪影识别与质量控制¶

伪影是由制样、光学、探测或处理产生，却可能被误认为样品结构的信号。识别伪影需要改变一个条件并观察图样是否随之改变，判断依据来自对照与条件变化，而非图样是否符合预期。

日常质量控制从标准化观察样和简单检查开始：照明是否均匀，目标在不同视野位置是否仍能聚焦，物镜切换后尺度和中心是否稳定，荧光通道有无明显串色，探测器是否出现饱和、固定图样或漂移。定量研究再依据用途加入空间标定、点扩散函数、照明平场、探测器线性和通道配准等检查。QUAREP-LiMi 将这些仪器与图像指标组织为持续的质量保证，而不是在图像异常后才做一次清洁。⁹

清洁应先定位污物所在平面并从最温和的方法开始。外露灰尘可用合适吹球移除，指纹或浸液只用厂家认可的无尘材料和清洁液处理；液体不直接滴在镜片上，内部光学件和滤光块交由维护人员。油浸物镜在使用后及时清洁，避免干结和污染干式物镜。乙醚—乙醇混合液、二甲苯或某一种酒精都不是所有涂层、胶合剂、塑料和污染物的共同清洁剂，实际方案以型号说明与化学安全规则为准。¹⁰

图像数据、处理与证据边界¶

数字显微图像中的每个像素都有位置和强度，因而属于原始数据。采集时要避免不可逆饱和、过低信号和不足采样，并保存包含元数据的原始格式。记录至少包括样品与制备批次、显微镜和物镜、放大倍数／NA／浸液、成像模式、滤光片或波长、相机与像素尺寸、曝光或激光功率、增益、焦层或 \(z\) 步长，以及采用的平场、去卷积、投影和拼接步骤。¹¹

亮度、对比度或伪彩调整若用于比较，应对预先定义的整幅图或全部可比图像采用一致规则，并保留未处理数据和处理轨迹。选择性增强一个区域、克隆删除尘点或细胞、把不同视野无标识地拼成连续组织，都会改变证据。裁切可以突出区域，但须保留足以理解取样背景的信息；强度定量应尽量在原始或经过一致、已验证校正的数据上完成。图像中显示比例尺、颜色含义、投影方式和裁切边界，正文再说明如何从图像选取视野、分割对象和汇总到生物学重复。¹²

一张清晰图像首先支持“在这套制样与成像条件下出现了这样的空间信号”。要进一步断言结构天然存在、两分子直接结合、信号强度等于含量或处理导致某种机制，还需要替代标记、活体观察、不同制样方法、扰动与救援、独立测量或时间证据。显微镜擅长把空间关系转成可检验的问题；可靠结论来自图像与其他证据相互约束，详见细胞生物学的证据层级和后续实验设计、记录与数据质量。

参考资料与延伸阅读¶

• Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Looking at the Structure of Cells in the Microscope. Molecular Biology of the Cell, 4th ed.
• Cooper GM. Tools of Cell Biology. The Cell: A Molecular Approach, 2nd ed.
• Nikon Instruments. Numerical Aperture；Properties of Microscope Objectives；Microscope Alignment for Köhler Illumination.
• Nikon Instruments. Eyepiece Reticle Calibration；Comparison of Phase Contrast and DIC Microscopy；Specimen Preparation and Imaging.
• Boehm U, et al. QUAREP-LiMi: a community endeavor to advance quality assessment and reproducibility in light microscopy. Nature Methods. 2021;18:1423–1426.
• Schmied C, et al. Community-developed checklists for publishing images and image analyses. Nature Methods. 2024;21:170–181.
• US Office of Research Integrity. Guidelines for Best Practices in Image Processing.
• ZEISS Microscopy. Microscope Cleaning and Maintenance.