组织学染色与细胞成像¶

组织和细胞成像把空间位置加入生物学证据。石蜡切片上的核与胞质颜色、荧光图像中的点状信号、电子显微镜中的膜性结构，都是取材、固定、脱水或冷冻、切片、染色或标记、照明、探测与图像处理共同形成的观测结果。读图时既要辨认结构，也要沿制样链追问哪些成分被保存、抽提、遮蔽或重新分布。

经典组织学训练是理解这条证据链的直观入口。取材方向决定切面，固定速度决定自溶能否被及时抑制，石蜡包埋让组织具有可切性，苏木精—伊红染色（hematoxylin and eosin staining，H&E）把核酸丰富区和蛋白丰富区转成可比较的颜色。福尔根、PAS 和酶组织化学进一步把某类化学反应限制在原位；免疫荧光、原位杂交、荧光蛋白和免疫电镜则增加分子选择性。现代方法扩展了可见对象，同时仍受样品状态、试剂可达性、标记性能和取样设计约束。

制片与成像路径应由问题决定。石蜡、冰冻、压片、染色体铺片和常规电镜等形态学方法，与空间标记、活细胞成像和图像质量控制共同构成实验框架。显微镜光路、放大与分辨、低倍至高倍观察、测微和基础装片见显微观察与标本制备；危险固定剂、二甲苯、强酸、重金属和放射性材料须先按实验安全、伦理与风险管理完成机构风险评估。

从问题选择空间读出¶

制样方案首先取决于要保存和识别的对象。观察器官层次与一般细胞形态，固定石蜡切片配合 H&E 往往足够；观察脂滴、可溶性酶活或某些易被有机溶剂抽提、热处理破坏的表位，冰冻切片或新鲜标本可能更合适；观察膜、核糖体和细胞器超微结构，需要能承受电子束的超薄或冷冻制样。一个方法在形态保存上表现良好，不保证它同时保留抗原、核酸、脂质和酶活。

空间问题还要区分“看见某种形态”“把信号定位到某处”和“证明分子身份”。H&E 或相差像主要提供形态背景，化学染色响应一组官能团或反应条件，抗体和核酸探针增加靶标选择性，遗传编码标记可在活细胞中追踪，但每类标记都有非特异结合、表达扰动或反应不完全。把两种颜色叠加只能说明当前分辨率和取样条件下信号接近；直接相互作用、功能依赖和因果顺序仍需独立实验。

同一项目常保留相邻材料走不同路径。一块用于常规形态，一块用于免疫或原位杂交，一块用于电镜或分子检测，能够在相近生物背景下比较保存偏倚。分样前记录个体、器官、部位、方向、缺血或离体时间以及父子样编号；不同小块不能默认具有完全相同的病变、细胞组成或处理历史。

取材、方位与固定¶

组织离体后会继续发生酶促降解、渗透压变化和缺氧反应。取材应迅速而有方向：写明器官的近远端、背腹面、皮质—髓质或病灶—邻近区关系，保留必要的整体照片，并让目标结构能够出现在预计切面。组织块越厚，固定剂到达中心所需时间越长；灌注固定、浸泡固定和培养细胞原位固定具有不同的扩散与暴露条件，不能只比较名义固定剂浓度。

醛类固定剂以交联稳定蛋白和部分空间关系。甲醛／多聚甲醛配制体系常用于光镜、免疫标记和原位实验，戊二醛交联更强，常有利于超微结构保存，却可能增加自发荧光并降低表位可及性。甲醇、乙醇和丙酮等沉淀型固定剂兼具脱水和膜通透作用，可能抽提脂质、使蛋白变性。四氧化锇可固定并增加不饱和脂质的电子密度，适合部分电镜流程，但具有强毒性和挥发风险，只能在相应设施与受控流程中使用。

一套教学方案以约 \(5\ \mathrm{mm}\times5\ \mathrm{mm}\times2\ \mathrm{mm}\) 的组织块、40 g/L 多聚甲醛、约二十倍固定液和 6 h 固定示范取材—浸泡关系。这些条件适用于相应课堂材料，实际固定要依据组织厚度、脂肪或钙化程度、温度、下游抗原／核酸／酶活和已验证的标准操作规程（standard operating procedure，SOP）决定；过短会留下自溶和中心固定不足，过长或条件过强则可能使组织硬化、收缩并掩蔽表位。

固定带来的变化需要对照。可以比较新鲜／活体像、不同但合理的固定体系、冷冻与石蜡相邻样，或用已知结构和阳性材料判断保存质量。固定不充分的边缘清楚—中心模糊、组织裂隙、胞质颗粒流失和异常自发荧光，都应作为制样结果记录，而不是在图像处理阶段删除。

石蜡切片与 H&E 染色¶

石蜡制片把含水软组织转成可连续切取的固体块，经典顺序为固定、清洗、梯度脱水、透明、浸蜡、定向包埋、修块、切片、展片与贴片。切片染色前再脱蜡、经递减有机溶剂复水到水相，完成水性染色后反向脱水、透明并用相容封固剂封片。这个往返过程解释了为何含水步骤、石蜡和非极性封固体系之间需要过渡介质。

梯度乙醇逐步替换水，透明剂再替换乙醇并与熔融石蜡相容。二甲苯是经典透明剂，也会使组织变硬、抽提脂质并带来吸入和易燃风险；是否采用二甲苯或替代体系由实验室验证和安全条件决定。无水乙醇承担脱水，二甲苯承担透明与石蜡过渡；二甲苯与水不相容，须在充分脱水后使用。透明不足会妨碍浸蜡，过度脱水、透明或高温浸蜡又会增加脆裂、收缩和抗原损失。

包埋时让目标切面朝向预定刀面，并把样品编号固定到包埋盒和蜡块谱系。修块时保留适当石蜡边缘，使组织受力均匀；切片厚度按组织、染色和成像用途选择。刀片缺口会产生连续刀痕，蜡块与环境温度不合适可形成压缩或颤刀纹，展片过热会使组织伸展过度。皱褶、重叠、脱片和切面方向错误都改变可见结构，应在染色前检查。

H&E 是形态学背景染色而非分子特异定量。苏木精经氧化形成 hematein，并与媒染剂构成的染料复合物使细胞核和其他嗜碱性结构呈蓝紫色；分化与返蓝步骤影响核的清晰度和色调。伊红为酸性染料，主要使富含碱性蛋白的胞质、细胞外基质和红细胞呈不同程度的粉红至红色。固定、切片厚度、染液状态、pH、时间、分化、返蓝和终末脱水均会改变颜色，不能把“更深”直接等同于某成分绝对更多。¹

“二甲苯—乙醇梯度—水—苏木精—水洗—伊红—乙醇梯度—二甲苯—树胶封片”构成经典操作骨架；每缸约 10 min、固定染液浓度或固定更换次数只适用于相应教学方案。染色批次应含已知形态良好的控制切片，并记录染液批次、过滤或更换状态、实际时间和异常。封片前若水未被彻底移除，非水性封固体系中可能出现乳白、折射不均或耐久性下降，但透明时间过长同样会造成脆化和褪色。

冰冻、树脂、整体与染色体制片¶

冰冻切片省去石蜡浸透，常用于保留脂质、部分酶活和某些对固定敏感的表位，也可快速取得切片。冻结速度、包埋介质、切片温度和组织含水量影响冰晶、卷片、裂纹和脂肪组织形态；“更少化学处理”不等于无伪影。固定前冰冻、固定后冰冻和活体组织切片保留的信息不同，需按下游染色说明。

树脂包埋提供较高硬度，适合半薄光镜切片、未脱钙骨组织和常规超薄电镜切片。树脂类型、聚合温度和切片厚度会影响形态、电子对比和抗原性。整体装片、压片、涂片和离析则保留或牺牲不同的空间关系：整体装片适合小型透明样品，压片展开密集细胞，涂片分散游离细胞，离析显示单细胞形态。它们的基础操作和机械伪影见装片、离析、压片与涂片。

经典细胞遗传学把分裂细胞停留在适当时期，经低渗处理、固定和滴片形成中期染色体铺片，再用 Giemsa 或带纹技术观察染色体数目、大小、着丝粒位置和条带。低渗时间、固定、滴片高度、湿度与干燥速度共同决定染色体是否重叠、过度伸展或破碎；一个“漂亮中期”不能代替多个独立细胞的核型评估。果蝇唾腺多线染色体的横纹、chromocenter 与 puff，以及植物粗线期染色体和减数分裂构型，仍是连接形态与遗传推断的重要经典材料；制片条件和发育时期必须随标本记录。²

细胞化学与组织化学反应¶

细胞化学通过原位反应把化学基团或酶活动转成有色、荧光或电子致密产物。理想反应既要有选择性，也要让产物在生成位置附近迅速固定；底物扩散、反应产物溶解、内源性背景和样品通透性都会造成定位偏差。每种方法至少需要不加关键底物／试剂的反应对照、已知阳性材料和与目标反应相匹配的抑制或消化对照。

福尔根反应保留了经典的 DNA 原位显示路径。受控酸水解使 DNA 脱嘌呤，脱氧核糖残基形成可与 Schiff 试剂反应的醛基，产生紫红色信号；它的关键并非先把磷酸二酯主链普遍切断。水解不足时醛基暴露不够，过度水解则使 DNA 和反应位点流失，所以同批材料应保持厚度、温度和时间一致。未水解对照、DNase 处理与 RNase 处理可以帮助判定反应来源。线粒体和叶绿体 DNA 在化学原理上同样可反应，是否能在普通光镜中清楚看见取决于拷贝量、空间尺度、保存和信噪比，不能写成一概“不被染色”。³

过碘酸—希夫反应（periodic acid–Schiff reaction，PAS）以高碘酸氧化邻二醇等结构产生醛基，再由 Schiff 试剂显出紫红色。它可显示糖原、部分中性黏液物质、糖蛋白和基底膜等富含相应糖基的结构，反应范围比“多糖”更广。相邻切片先用淀粉酶消化，可检验信号中可消化糖原的贡献；省略高碘酸、已知阳性组织和试剂空白用于定位其他背景。马铃薯切片经高碘酸—Schiff 显色是一项经典练习，其中 70% 乙醇过渡、反应时间和漂洗次数须按材料与试剂验证。

酸性和碱性磷酸酶组织化学利用酶水解底物后形成局部不溶性捕获物。经典铅法或钙—钴法再经硫化物转成深色沉淀，形象展示“酶反应—捕获—显色”的链条；同时涉及铅、钴、硫化物和挥发／反应危险，不能脱离机构 SOP 照录。酶活对固定、温度、pH 和底物可达性敏感，扩散的磷酸根或沉淀会扩大信号。无底物对照、热灭活或选择性抑制、已知阳性组织及相邻形态切片共同限定定位。低温预处理或短时固定可能改变膜通透性和酶保存，但不能笼统解释为“使底物更容易进入溶酶体”而忽略酶活损失。

苏丹 Ⅲ 等脂溶性染料适合在避免常规石蜡有机溶剂抽提脂质的切片或临时材料上显示脂滴。花生子叶徒手切片仍是直观练习；应把染色颗粒与组织结构、溶剂空白和已知脂质材料比较。挥发和易燃风险主要来自乙醇、异丙醇等配制溶剂，而非苏丹 Ⅲ 本身。Janus Green B 的氧化还原状态可使富含线粒体的区域产生动态颜色，但染料分布、细胞状态和氧化还原环境共同影响结果，一次着色只提供颗粒身份的初步线索。

去污剂抽提洋葱表皮、戊二醛固定和考马斯亮蓝 R-250 染色可作为差异抽提后的蛋白骨架练习。Triton X-100 会去除膜和大量可溶蛋白，考马斯亮蓝对蛋白结合而不专一识别微丝、微管或中间纤维；所见网状残留是抽提、塌缩、固定和非特异蛋白染色的共同结果。若要判定具体骨架成分，应增加抗体、荧光融合蛋白、药理扰动或遗传扰动，并与未抽提样本比较。

免疫标记、原位杂交与空间特异性¶

免疫荧光和免疫组织化学依赖抗体在当前制样条件下识别可接近表位。直接法把标记连接到一抗，步骤少且便于多标设计；间接法用标记二抗识别一抗，常有信号放大和试剂通用性。酶标法可由 HRP—DAB 等体系形成局部有色沉淀，适合明场和耐久切片；荧光法允许多通道和较细的空间分析，但受自发荧光、串色、漂白和探测器范围影响。

固定和抗原修复是测定条件的一部分。交联可能遮蔽表位，热或酶促修复可恢复部分可及性，也可能破坏形态或产生新的背景；去污剂决定抗体能否进入胞内区室。抗体必须针对具体物种、组织、固定、修复和检测体系验证。已知阳性与阴性组织、靶基因敲除或敲低、独立抗体、正交检测、无一抗和仅二抗对照分别回答不同问题；单独吸收对照或厂家 Western 条带不能证明组织中每处着色都是目标分子。⁴

原位杂交（in situ hybridization，ISH）用互补核酸探针在细胞、切片、整体胚胎或染色体上定位 DNA 或 RNA。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）把信号转为荧光，可以在中期染色体上显示探针相对位置，也可在间期核或组织中计数与定位。完整链条包括样品固定和通透、探针身份与标记、靶序列与探针变性、杂交、适当严紧性洗涤、信号检测和复染。无探针、错义／竞争探针、已知阳性与阴性样、RNase 或 DNase 处理按靶标选择；信号数还受切片截断、核重叠、杂交效率和阈值影响。FISH 针对指定序列提供空间信息，全基因组结构和转录功能则由经典核型、测序和表达测量提供互补证据。⁵

空间报告至少写明样品与处理、固定和切片方式、抗体或探针身份、标记与检测体系、阳性／阴性结果、成像条件以及观察者如何定义结构和强度。MISFISHIE 将这些内容分为实验设计、生物材料、报告分子、染色、图像和图像表征六类，使读者能够复核定位结论而不是只看到一张代表图。⁵

荧光蛋白、活细胞与互作成像¶

活细胞成像保留时间顺序和运动信息，也把标记表达、照明剂量和培养环境引入实验。遗传编码荧光蛋白可与目标蛋白融合或由启动子报告表达；化学染料可以响应核酸、膜电位、离子或酶活。开始前要验证标记是否改变蛋白定位、稳定性和功能，控制表达水平，并记录温度、气体、渗透压、培养基背景和观察时长。未标记细胞、单通道样品和已知响应控制用于识别自发荧光、串色和探针失效。

时间序列同时受到光漂白和光毒性。曝光、激光功率、扫描速度、焦层数和采集频率共同决定光剂量；采得更密可能更快破坏待观察过程。焦点漂移、细胞迁移、分裂和形态变化会改变感兴趣区域，强度曲线不能只以初始轮廓机械追踪。实验应在能够回答问题的最低合理光剂量与时间分辨率之间平衡，并用未照明或低照明组检查成像本身的影响。

双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）把荧光蛋白拆成两个本身不发光的片段，分别连接到候选互作蛋白；两种融合蛋白接近并促成片段互补后出现荧光，可在细胞内显示候选复合体的位置。荧光团成熟需要时间，互补常具有很强的稳定性甚至近似不可逆，过表达和片段自发组装也可捕获短暂接近。因此信号位置可能晚于最初相遇位置，阳性反映片段互补而非直接接触的充分证明。已知破坏互作界面的突变体、融合方向互换、表达量核对、非互作伙伴、竞争和独立方法是关键控制。⁶

共定位、BiFC、Förster 共振能量转移（Förster resonance energy transfer，FRET）和荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）回答不同问题。共定位说明空间分布在当前分辨率下重合；FRET 对供受体距离和取向敏感，但需要串色、直接激发和光物理校正；FRAP 的恢复曲线结合漂白几何和模型可估计移动组分与表观交换动力学，却会混入扩散、结合、细胞运动和持续漂白。将这些读出与遗传扰动、免疫沉淀、功能救援或单分子方法组合，可以逐步排除替代解释。

电子显微镜与超微结构¶

常规透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）以塑料包埋超薄切片中的电子透射与散射形成对比。经典制样依次包括小块取材、醛类初固定、四氧化锇等后固定、梯度脱水、树脂浸透和聚合、超薄切片、载网承载及重金属对比。醛类、锇、铀和铅试剂分别影响膜、蛋白、核酸与整体电子密度，但“被某重金属染深”不等同于该成分的专一化学鉴定。固定慢、脱水收缩、树脂聚合、刀痕、压缩、污染、电子束损伤和离焦都会制造超微结构伪影。⁷

负染色让电子致密盐包围或进入小颗粒背景，以轮廓反差观察病毒、囊泡或大分子复合物；干燥和染料颗粒会改变形态。冰冻断裂沿膜和其他薄弱界面裂开，蚀刻与金属—碳复型记录断裂面；凸凹颗粒和阴影来自断裂、复制与观察方向，不能当作普通表面照片。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）通常观察表面发出的二次电子，生物样品常需固定、脱水、干燥、安装和导电镀膜；临界点干燥等方法用于减小表面张力造成的塌陷，镀层和充电仍会影响边缘与纹理。

冷冻电镜和冷冻电子断层以玻璃态冰中的样品减少化学固定、脱水和树脂包埋造成的改变，扩展了近天然状态结构研究。它们仍受冰厚、冻结速度、取向、电子剂量、束致运动和计算重构影响，仍需识别相应伪影。相关光—电镜（correlative light and electron microscopy，CLEM）先用光学标记定位事件，再在电镜中观察同一区域结构，能够把分子线索与超微结构连接起来；配准误差、制样后形变和两种成像尺度差异必须报告。

免疫电镜可在包埋前或超薄切片上用铁蛋白、酶反应物或胶体金等电子致密标记定位抗原。包埋前标记常有较好的表位可达性但组织穿透受限，包埋后标记保留切面定位却依赖树脂与固定后表位。颗粒附近存在目标的结论须结合无一抗、非相关抗体、阳性结构、颗粒密度和独立定位证据；单个金颗粒不能自动界定一个细胞器或分子复合体。

图像采集、取样与定量¶

成像实验的独立单位通常是动物、植株、培养批或独立处理的培养皿，切片、视野、细胞和像素位于其下层。同一块组织连续切十张片、每张取十个视野，并不会产生一百个独立生物重复。取样方案应预先规定器官层面、切面方向、切片间隔、每个单位的视野数和排除条件；病灶边缘、中心和对照区要按问题分层，而不是在看完图像后挑选最清楚区域。

可比较图像应在避免饱和、具有足够信噪比和空间采样的范围内采集。物镜、数值孔径、浸液、相机／探测器、像素尺寸、曝光、增益、激光功率、针孔、\(z\) 步长、滤光片和通道顺序都可能改变信号。不同组使用同一设置有利于比较，但若样品跨度超过探测器范围，应采用预先验证的分档或校准方法，而不是让一组饱和、另一组接近噪声。照明均匀性、空间标定、通道配准和点扩散函数按定量用途进行周期核查；QUAREP-LiMi 将这些内容组织为持续的仪器和图像质量保证。⁸

分割、计数和强度测量从原始像素得到新的数据对象。阈值、背景区域、平滑、去卷积、焦层投影、对象合并／拆分和人工修正都要预先说明并保留处理轨迹。最好在不知道分组的条件下建立或验证规则，再固定应用于全部可比图像；训练型算法还需分离训练、验证和测试材料，检查不同批次和组织的域偏移。比例尺必须由当前配置校准生成，伪彩颜色、投影和裁切在图注中说明。

原始文件、采集元数据、处理脚本或参数、区域选择和汇总层级共同构成图像数据谱系。REMBI 建议按生物学研究、样品、成像和数据层描述显微数据，社区图像发布检查表进一步要求清楚呈现尺度、颜色、处理和分析流程。它们的目的不是增加表格负担，而是使读者知道图像从哪个样品、用何种配置、经过什么处理得到。⁹¹⁰

伪影的定位与正交确认¶

组织收缩、裂隙和空泡可能来自缺血、固定、脱水或真实病变；核周深色可能来自染色分化，也可能是染色质凝集；荧光点可能是目标颗粒、自发荧光、二抗聚集或探测器热像素。定位伪影的有效方式是改变一个可能来源并追踪图样：移动样品判断污点所在光学平面，比较相邻切片和不同固定，检查无标记与单标对照，改变焦层确认信号体积，重做独立样本检验是否随批次重复。

形态、化学和分子证据可以互相约束。H&E 提供组织背景，PAS 或酶组织化学说明一类反应，抗体或探针提供候选身份，遗传缺失、药理扰动和功能测量检验必要性，电镜补充超微结构。不同方法共享样本或试剂时也会共享偏倚：同一固定方式下的两种抗体并非完全独立，同一荧光融合蛋白的共定位与 FRAP 仍共同依赖标签行为。正交确认要尽量改变识别原理或证据层级。

最终结论应保持在读出范围内。可以写“在当前固定和染色条件下，该区出现 PAS 阳性物质”“抗体依赖信号主要位于核周”“BiFC 互补信号与膜区重合”或“超薄切片中见双层膜样轮廓”，再说明控制与替代解释。只有当身份、空间、数量和功能证据相互支持时，才把图像推进到更强的机制判断。

参考资料与延伸阅读¶

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• Chieco P, Derenzini M. The Feulgen reaction: A brief review and new perspectives. Acta Histochemica. 2017;119:603–609.
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• Sarkans U, et al. REMBI: Recommended Metadata for Biological Images—enabling reuse of microscopy data in biology. Nature Methods. 2021;18:1418–1422. https://doi.org/10.1038/s41592-021-01166-8.
• Schmied C, et al. Community-developed checklists for publishing images and image analyses. Nature Methods. 2024;21:170–181. https://doi.org/10.1038/s41592-023-01987-9.