细胞培养、计数与活性检测¶

细胞离开组织以后，培养液、基质、气相和传代操作共同构成了新的生活环境。培养皿中的细胞会随传代、密度和选择压力继续变化，因此一次细胞实验至少包含三条彼此相连的证据链：材料身份与声称一致，培养过程的污染和漂移得到控制，末端读数对应研究问题。良好细胞与组织培养规范（Good Cell and Tissue Culture Practice，GCCP）由此贯穿取材、建库、复苏、扩增、计数、处理和报告，无菌操作只是其中一个环节。¹

培养对象与培养系统¶

原代培养从新取出的组织或细胞开始，较多保留供体的分化特征和异质性，同时会受取材、缺血时间、消化和供体差异影响。经首次传代以后可称为传代培养；其中有复制寿命限制的是有限细胞系，能够长期传代的是连续或永生化细胞系。“原代约十代、有限系四十至五十代”是帮助理解 Hayflick 式有限增殖的历史概数，具体判定仍取决于物种、组织和培养条件。连续生长可能来自肿瘤来源、自发改变、病毒或外源基因介导的永生化，核型异常和接触抑制减弱也并非每个连续系必然同时具备。HeLa、BHK-21 和 CHO 是经典连续系，但各自的来源、基因组和培养要求不同。²

从单个细胞扩增所得群体称为克隆；经典教材还把从细胞系中选择出的、具有特定遗传标志或表型的亚群称为细胞株（cell strain）。实际使用时应报告实验室采用的定义、选择过程和亲本关系，因为“克隆”表示共同起点，后续细胞仍可继续分化。贴壁与悬浮描述生长方式，有限与永生描述复制寿命。体外细胞常呈上皮样、成纤维样或游走样外观；形态变化适合日常监视，组织来源与身份还需专门的认证证据。

动物组织常经剪碎后用胰蛋白酶、胶原酶或其他解离体系，并可用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）降低依赖二价离子的细胞黏附。酶种类、浓度、温度、机械剪切和暴露时间会选择性地损伤或丢失某些细胞；所得悬液应结合回收率、团块比例、活性和目标标志评估。基础培养基提供盐、能源、氨基酸和维生素，缓冲体系须与培养箱 CO\(_2\)、温度、渗透压及容器气体交换相配；血清、生长因子、细胞外基质和饲养层则可能同时提供生长信号并带来批间差异。植物细胞培养还包括小孢子或花药途径获得单倍体材料、愈伤组织与原生质体培养，其激素比例、细胞壁再生和形态发生条件须按物种与外植体建立。

无菌操作与污染控制¶

无菌操作的目标是阻断人员、空气、试剂、器具和相邻培养物之间的传播。操作前按风险选择生物安全柜和个人防护，区分清洁物与废弃物的运动方向；同一时段尽量只处理一种细胞，移液器和培养基分装专用，瓶口与枪头不跨越开放容器。培养物澄清、pH 正常或显微镜下外观正常只提供有限的污染线索，酵母、真菌、细菌或支原体还需相应检测。常规抗生素可能掩盖低水平污染并改变细胞生理，良好操作和检测仍是主要控制手段。

新到或来源不明的细胞先隔离，确认后再进入共同培养区和细胞库。支原体可改变代谢、染色体、基因表达和药物反应，又对许多常用抗生素不敏感；检测频率应覆盖入库、解冻后、重要实验前和出现异常时，并依据材料与法规选择培养、核酸扩增、DNA 染色或经验证的组合方法。阳性培养物的处置、清场和复测遵循机构方案，珍贵且不可替代的材料是否尝试清除污染，需要把交叉传播和残留风险一并评估。³

身份确认与细胞库¶

细胞名称、来源库与目录号、Cellosaurus 标识或研究资源标识符（Research Resource Identifier，RRID）、物种、供体、组织、建立方式和已知遗传改变共同描述材料。开始使用前先查 Cellosaurus 与国际细胞系认证委员会（International Cell Line Authentication Committee，ICLAC）的误认记录；人细胞系通常以短串联重复序列（short tandem repeat，STR）或适用的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）谱与可靠参考比较，非人细胞至少确认物种，并按问题补入个体或品系分辨。身份认证验证物种与供体是否相符，形态、标志蛋白、核型和目标突变则回答分类、状态或遗传构成，几类证据各有用途。⁴

早期、已认证且污染阴性的材料建立主细胞库，日常实验从工作细胞库复苏。冻存记录包括批次、亲本、冻存日期、培养条件、传代号或累计群体倍增数、活性与质控结果；冻存密度、降温程序、保护剂、储存温度和快速复苏条件均须针对材料验证。每次实验从限定代次窗口取材，可以缩短漂移链，但传代号只记录操作次数，无法代替累计分裂、培养时长或功能性比较。

生长状态、传代与同步化¶

传代时记录接种细胞数、培养面积或体积、贴壁回收、团块比例、汇合度、换液和收获时间。若接种与收获都以可回收活细胞数表示，一段培养的群体倍增数可写为

存在明显贴壁损失、滞后或死亡时，这个端点比值混合了增殖、丢失和存活。倍增时间宜从适用生长区间的时间序列估计，并报告模型与取样点；高汇合、营养耗竭和选择性脱落都可能使单一端点偏离指数生长。

天然同步材料包括某些早期胚胎细胞和同步核分裂的多核体系。人工富集的经典方法仍有明确的实验价值：分裂期细胞变圆、附着减弱时可用轻柔振荡收集；体积或密度差较大的材料可作梯度分离；过量 thymidine 或 hydroxyurea 阻断 DNA 合成后洗脱，可富集 G\(_1\)/S 附近细胞；colchicine、colcemid、nocodazole 或 vinblastine 干扰微管，常用于富集有丝分裂期。振荡得到的细胞少且仍有机械选择，梯度只适合确有大小或密度差的材料，化学阻断还会造成复制压力、微管扰动和应激。处理后应以 DNA 含量、EdU、周期蛋白或单细胞追踪验证富集及释放动力学，并把未处理群体和不同原理的方法作为参照；“富集”不表示所有细胞处于相同分子状态。⁵

血球计数板的直接计数¶

经典血球计数板以四条沟分隔三个平台，中央计数平台比两侧低 \(0.1\ \mathrm{mm}\)；专用盖玻片正确就位后，这一高度差限定计数室深度。中央网格的双线和小格单线帮助界定面积，但不同型号的网格尺寸并不完全相同。计算前必须确认所计区域的实际面积、深度和由此得到的体积，不能只凭“数了几个格”套常数。ISO 20391-1 将直接与间接、总数与分类计数放在同一测量框架内，强调方法选择、测量过程、数据分析与报告。⁶

操作从清洁计数板和盖玻片开始，镜检灰尘、划痕与残留物，并确认盖玻片贴合。细胞悬液在每次取样前温和而充分地混匀，必要时按预定比例稀释和排染；液滴置于盖玻片边缘，由毛细作用充满计数室。液体进入沟槽、过量溢出、气泡、局部干涸或两室充盈不一致均应重新装样。装样后让细胞在经验证的短时间内沉降到同一焦面，再在蒸发和沉降偏倚明显之前计数；只有经过分布验证的体系才可省略静置步骤。

为避免边界细胞重复，预先固定“计上、计左，不计下、不计右”的规则；双边线按上方与左方的规定线及其夹角判定，并对所有计数区一致执行。动物细胞团只有在单个边界可以可靠分辨时才逐个计数，否则应优化温和解离、记录团块并规定团块的计数方式。酵母出芽体可沿用“芽体小于母体一半合计一个、大于一半计两个”的教学规则，但必须把它声明为本实验的操作定义。计数多个预定区域和两个计数室，比较室间差异和空间梯度，能揭示混匀、装样或聚团问题。

若每个区域体积为 \(V_{\mathrm{grid}}\)，计数 \(m\) 个区域共得 \(\sum n\) 个细胞、稀释倍数为 \(d\)，则原悬液浓度为

标准 \(1\ \mathrm{mm^2}\) 大格在 \(0.1\ \mathrm{mm}\) 深度下体积为 \(10^{-4}\ \mathrm{mL}\)，此时才可写成 \(C=\bar n\,d\times10^4\ \mathrm{cells/mL}\)。报告应包括计数板型号、区域、稀释与染色、边界和团块规则、重复数、原始计数及汇总方法。

光学密度、形态与体积估计¶

细胞悬液的 \(A_{660}\) 或其他波长散射读数可以快速追踪相对生物量，但其与细胞浓度的比例关系只在特定仪器、光程、细胞类型和密度范围内成立。细胞大小、形状、聚团、色素、碎屑和培养基本底会改变信号，应以同一状态下的直接计数或干重建立校准曲线，超出线性范围先稀释。它是间接计数，不自动等同于活细胞数。

显微测得长、短轴后，可把近似旋转椭球的体积写成 \(V=4\pi ab^2/3\)，球形近似为 \(V=4\pi r^3/3\)；这里的 \(a\)、\(b\) 和 \(r\) 都是半轴或半径，须从直径换算并统一单位。核质比常写作 \(V_{\mathrm{nucleus}}/(V_{\mathrm{cell}}-V_{\mathrm{nucleus}})\)。二维轮廓、细胞压扁和焦层选择会把几何模型误差带入结果，必要时用三维成像或体积校准补充。血球计数板与早期血细胞计数共享方法史；现代血常规属于有校准、质控和临床参考范围的自动化检验体系，不由一次教学手工计数替代。

膜完整性与经典死活判定¶

台盼蓝、伊红、苯胺黑和赤藓红等排染利用完整质膜限制染料进入，碘化丙啶（PI）和溴化乙锭（EB）也常用于标记膜完整性已丧失的细胞。计数时同时记录排染细胞与总细胞，可计算

排染反映取样时的膜完整性，未必识别早期凋亡、暂时性膜损伤或以后还能否增殖；染料浓度、接触时间、温度、团块和操作者分类都会影响结果。台盼蓝手工与自动计数均需在各自样品范围内验证，PI、EB 等核酸染料还须按机构化学安全要求使用。⁷

荧光素二乙酸酯一类亲脂底物进入细胞后，由胞内酯酶释放荧光产物；calcein-AM 等探针也将酯酶活性与产物保留结合起来。它们报告的是酶活和膜状态的组合，不是普遍的“活细胞专一反应”。酵母亚甲蓝脱色利用细胞还原能力，结果会随代谢状态与染料条件变化。植物细胞的质壁分离与复原可观察渗透响应和原生质体状态；卡宝品红则会杀死、固定并染色，适合固定标本观察，不能与活细胞排染合并解释。

代谢、增殖与长期存活读出¶

MTT 及水溶性四唑盐、resazurin、胞内蛋白酶底物和 ATP 发光法，都以活细胞相关的还原、酶或能量状态估计可存活细胞量。MTT 形成需要溶解的甲臜，WST 类产物多留在细胞外；resazurin 还原产生荧光或吸收变化；ATP 法通常在裂解后读数。中性红摄取偏向溶酶体保留，SRB 或结晶紫反映附着总生物量，DNA 染料反映核酸量，EdU／BrdU 掺入反映 DNA 合成，克隆形成实验则检验单细胞长期增殖成群落的能力。经典 MTT 论文把其用于生长与存活定量，但信号也受细胞激活和代谢状态影响。⁸

这些读数首先是代理指标。处理物可能直接还原染料、吸收或淬灭检测波长、影响 ATP 而未杀死细胞，也可能造成细胞静止、脱落或尺寸改变。每种细胞与试剂组合都要确定细胞数、试剂量和孵育时间的工作范围，设置无细胞加药孔、培养基空白、载体对照、阳性损伤对照和必要的正交终点。代谢下降、膜破裂、细胞数减少与克隆形成丧失若结论不同，应按各自的生物过程报告，而不强行归并为一个“存活率”。⁹

实验设计、分析与报告¶

先写清主要结局是活细胞浓度、活细胞比例、代谢信号、增殖速度、细胞毒性还是长期克隆能力。实验单位通常是独立培养或独立生物材料，来自同一培养物的多个孔主要反映加样和读板变异；板位应随机或平衡，边缘蒸发、接种次序和读数时间要记录。以零时刻细胞数配合时间序列，可以区分接种差异、死亡和增殖抑制。药物敏感性只按末端相对对照归一化，会受到对照组在实验期间分裂次数的影响；在比较生长速度不同的细胞时，可加入基于零时刻和对照生长的 growth-rate 指标。¹⁰

最终记录至少包括细胞身份与来源、认证和支原体状态、库批与代次或群体倍增、培养基和关键补充物批次、基质、温度与气相、接种密度、汇合度、处理和采样时间、计数或读出原理、仪器设置、原始数据、排除规则和独立重复。这样，同一份“活性下降”结果才可以沿着细胞材料、培养过程和检测反应逐层复核。

参考资料与延伸阅读¶

• Pamies, D. et al. Guidance Document on Good Cell and Tissue Culture Practice 2.0. ALTEX 39, 30–70 (2022).
• Geraghty, R. J. et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer 111, 1021–1046 (2014).
• International Cell Line Authentication Committee. Institutional Best Laboratory Practices for Authentication of Cell Lines and Tissue Samples (2023).
• Bairoch, A. The Cellosaurus, a Cell-Line Knowledge Resource. Journal of Biomolecular Techniques 29, 25–38 (2018).
• ISO. ISO 20391-1: Biotechnology—Cell counting—Part 1. 当前目录条目及 2018 版摘要。
• Louis, K. S. & Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology 740, 7–12 (2011).
• Riss, T. L. et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual (2013; updated 2016).
• Hafner, M. et al. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods 13, 521–527 (2016).