细胞死亡、融合与功能扰动¶

细胞数量减少、代谢读数降低和细胞死亡分别对应不同层面的观察。细胞可能停止增殖、脱落、进入衰老、暂时降低代谢，也可能跨过不可逆的死亡边界；已经死亡的细胞又会在培养液、收集和洗涤中选择性丢失。因此，死亡实验先要保全样品和时间信息，再把形态、膜完整性、生化执行步骤与可干预性连接起来。培养身份、计数和一般活性读出见细胞培养、计数与活性检测，各种死亡机制的生物学背景见细胞增殖、分化、死亡与衰老。

死亡判定与取样设计¶

在实验操作层面，细胞死亡以质膜不可逆通透或细胞完全碎裂为终点；受调控细胞死亡的具体名称还要求相应执行机制对结局具有因果作用。细胞缩小、肿胀、染色质凝集、膜起泡和碎片化仍是重要形态证据，却不能单独区分凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡或其他死亡方式。现代命名补充了机制层，但并不取消经典形态观察的价值。¹

实验应预先规定刺激、剂量、取样时刻和主要结局，并同时收集贴壁细胞、漂浮细胞与培养上清中的相关信号。只消化仍附着的细胞会系统性漏掉已经脱落的群体，过强消化和离心又可能制造膜损伤。死亡从启动、执行、清除到继发膜破裂具有时间顺序；单一末端比例容易把短暂事件、早期信号与终末损伤混在一起，时间序列至少应覆盖处理前、预期早期变化和最终结局。

阳性对照证明检测链能响应，未处理和载体对照给出基线，处理物无细胞孔用于发现荧光、吸收或发光干扰。若要给死亡方式命名，还需有不同原理的独立证据以及对执行模块的遗传或药理干预。细胞保护剂只有在浓度、暴露和自身毒性受控时才具有“救援”意义；它也可能只是延迟死亡或干扰检测反应。

Giemsa 与 DAPI 的经典形态观察¶

Giemsa 法保留了从整体细胞到细胞核判读的传统路径。一套教学方案把细胞用磷酸盐缓冲盐水（phosphate-buffered saline，PBS）调至 \(1\times10^6\ \mathrm{cells/mL}\)，取一滴涂片或使用细胞飞片，室温晾干，以甲醛固定 3–5 min；随后用 Giemsa 工作液染色 10–15 min，流水短洗、干燥、封片并镜检。正常细胞核多呈较均匀的蓝或蓝紫色；疑似凋亡细胞可见染色质固缩、周边化、深染，细胞轮廓收缩并伴膜褶皱或起泡。一个细胞可能形成多个凋亡小体，计数时必须先规定观察单位是细胞、细胞核还是小体。

这些体积、时间和染液浓度适用于相应教学方案，应按细胞类型、涂片厚度、固定液和商品工作液验证后形成标准操作规程（standard operating procedure，SOP）。分裂期染色体凝集、机械损伤、坏死晚期与制片收缩也可能产生深染或核碎裂；盲法判读、预设形态标准、足够视野和第二种终点可降低主观偏差。

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）法先观察培养物，再弃培养基并用 PBS 轻晃洗 1–2 次，以 \(-20\ ^\circ\mathrm{C}\) 预冷甲醇在 \(-20\ ^\circ\mathrm{C}\) 固定 10 min；PBS 再洗 1–2 次，在覆有 Parafilm 的载玻片上滴 \(70\ \mathrm{\mu L}\) DAPI 染液，将盖玻片细胞面向下置于液滴，避光染色 5–10 min，PBS 洗 3 次后制片镜检。DAPI 显示 DNA 分布，适合辨认核固缩与核碎裂，但对凋亡没有机制专一性；甲醇固定后的样品提供的是固定后形态，活体膜状态需在固定前另行检测。

吖啶橙可依据核酸结合状态产生不同颜色，Hoechst／DAPI 可显示核凝集，Giemsa 保留整体形态，这些染色都要结合成像条件和细胞周期解释。“细胞内颗粒物增多”只可作为初筛观察，凋亡定义还需其他证据。自动图像分析应保存分割规则、阈值和原图，并防止把碎片、多核细胞或相邻细胞误分为单细胞。

流式细胞术与膜状态¶

流式细胞术逐个记录散射和荧光，可快速分析大分子含量、细胞周期、死亡标记并分选仍能培养的细胞；其分子特异性来自所用探针和对照，悬液检测通常会丢失组织位置与完整形态。前向散射通常与细胞大小相关，侧向散射受内部结构和折射率影响；经典凋亡群体常出现前向散射降低、侧向散射改变，但材料、仪器和处理都会移动这些分布，不能用固定象限跨实验判定。

膜联蛋白 V（Annexin V）在 Ca\(^{2+}\) 存在时结合外露的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），再配合碘化丙啶（propidium iodide，PI）、7-氨基放线菌素 D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）或其他膜不透性染料区分取样时的膜通透状态。常见四象限可作描述：双阴性、Annexin V 单阳性、双阳性和膜染料单阳性；这些是操作性群体，死亡阶段与方式还需形态、执行者和时序证据。PS 也可在血小板活化和若干非凋亡情境中外露，膜通透又会随时间推进。²

面板建立要用未染、单染补偿或光谱解混对照、适当的缺一荧光对照（fluorescence minus one，FMO）和明确阳性材料。分析顺序记录时间稳定段、细胞范围、双联体排除和各生物学门；散射门应覆盖正在收缩、肿胀或碎裂的目标群体。把所有原始事件与门控层级保留下来，并报告仪器、激光与滤光片、补偿／解混矩阵、阈值、事件数和门的依据。³

DNA、半胱天冬酶与细胞器读出¶

核小体间切割可形成约 180–200 bp 及其倍数的 DNA 梯带；TUNEL 用末端转移酶标记可接近的 DNA 断端；彗星实验显示单细胞 DNA 迁移；固定细胞的 DNA 含量直方图可出现亚 G\(_1\) 群体。四种方法都读取 DNA 断裂或丢失的不同侧面。梯带缺失不排除凋亡，TUNEL 也可标记修复、坏死和制片产生的断端，亚 G\(_1\) 群体对早期及未大量丢失 DNA 的细胞不敏感，彗尾还受电泳条件和细胞裂解影响。

半胱天冬酶底物、活性探针、剪切型半胱天冬酶或 PARP 片段能够读取蛋白酶执行步骤，但底物可能交叉、切割可能短暂，某些死亡又不依赖经典执行者。线粒体膜电位染料（如罗丹明 123、TMRM 或 JC-1）响应染料分布、浓度、细胞大小和线粒体量；荧光下降可提示去极化，不能单独证明线粒体凋亡。细胞色素 c 释放、BAX／BAK 依赖与线粒体外膜通透化（MOMP）提供更接近机制的证据，但仍须同死亡终点相接。

GSH 与氧化还原探针、Ca\(^{2+}\)、转谷氨酰胺酶和细胞贴壁变化曾被用于补充观察；它们的方向和幅度依细胞背景而变。端粒酶活性不是公认的通用凋亡标记。检测液相 LDH、HMGB1 或炎症因子时还要校正自发释放、总可释放量、培养液降解和细胞数，避免把“膜漏”直接等同某一死亡机制。

死亡方式的因果证据¶

凋亡可由核凝集与膜起泡、PS 外露、半胱天冬酶执行、MOMP 或特异遗传依赖共同支持。坏死性凋亡需显示 RIPK3—MLKL 执行而非只测 RIPK3 丰度；焦亡需把炎症性半胱天冬酶、gasdermin 切割／成孔、膜裂解和细胞因子成熟连接；铁死亡需结合脂质过氧化、铁与 GPX4／system x\(_c^-\) 相关扰动及相应救援。膜破裂或细胞肿胀只是共同末端，不能替代这些因果链。

自噬体增多也不等于“自噬性死亡”。LC3-II、p62、溶酶体阻断前后的通量、双荧光 LC3 报告器和 ATG 遗传扰动先判断自噬是否增强及是否为死亡所必需。植物和酵母可以出现受调控死亡以及动物“凋亡样”形态，但细胞壁、液泡和谱系特有执行机制不同；实验应保留其传统观察名称，并用物种适用的分子证据限定解释。

细胞融合的产物与证据¶

细胞融合先使质膜连续、胞质混合，两个或多个细胞核可暂时共存。相同遗传背景细胞形成同核体（homokaryon），不同背景细胞形成异核体（heterokaryon）；之后核融合可产生 synkaryon，能够增殖并稳定传代的产物才进一步称为杂种细胞或杂种细胞系。只把一个去核胞质体同有核细胞组合可形成 cybrid。双核或多核形态还可能来自胞质分裂失败，两个细胞相贴也会造成假双阳性，所以“看到两个核”或“双荧光”都不是充分证据。

经典融合诱导包括灭活仙台病毒、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和电融合。仙台病毒包膜融合蛋白曾使不同物种的体细胞形成异核体；PEG 方法简便，但分子量、浓度、残液、温度、pH、细胞密度、暴露和洗脱共同决定融合与毒性；电融合先排列或使细胞接触，再以脉冲造成可逆膜失稳，场强、脉宽、脉冲数和缓冲液电导率影响产率与存活。三种方法都应同时报告融合率、死亡率、非融合双联体和多细胞融合。⁴

融合证据可以沿四层建立：膜染料或表面标志显示两类膜成分共存；可扩散胞质标记显示内容物混合；物种特异核标记、FISH 或基因型区分亲本细胞核；单细胞克隆、核型与功能表型证明稳定杂种。双标记实验需要单亲本、未诱导混合、单色和补偿对照；显微图像要以三维或连续焦层排除上下叠放，流式则严格排除双联体但保留真正的大型融合细胞。

鸡红细胞—PEG 经典实验¶

一套教学方案先以无菌注射器取 Alsever 液 1 mL 和鸡血 1 mL 注入无菌离心管，再加 Alsever 液 2 mL，于 4 ℃保存。实验时离心去除 Alsever 液，以生理盐水配成 5%–10% 鸡红细胞悬液。鸡血必须来自合规来源，采集、运输、锐器、离心和废物处置进入机构批准的动物与生物安全流程；保存时间和材料放行标准也应在方案中明确。

取细胞悬液 1 mL，加入 Hank’s 液 5 mL 混匀；教学方案记为 1,000 r，5 min，随后用移液器小心去上清而不直接倾倒，并用指弹使细胞充分分散。由于 r 没有说明每分钟转数（revolutions per minute，rpm）、相对离心力（relative centrifugal force，RCF）、转子或半径，这一数值需要换成经验证的 \(\times g\)、时间、温度、转子和制动方式后执行。

随后把 50% PEG 1 mL 在 1 min 内加入红细胞，边加边轻摇混匀，于 37 ℃处理 2–5 min；再贴管壁缓慢滴加 Hank’s 液 5 mL 终止，37 ℃静置 5 min。离心条件在教学方案中记为 1,000 r，3 min，同样需要换算和校准后再去上清、滴片镜检。这里“迅速加入 PEG”指在限定的一分钟内完成均匀接触，而终止液要逐步稀释 PEG；残液过多、细胞团未散、局部 PEG 过高、暴露过久和终止过快都会同时影响融合与渗透损伤。50% PEG 及 2–5 min 是示例条件，正式实验须按 PEG 分子量、细胞和用途做浓度—时间矩阵。

Hank’s 液是维持离子和渗透条件的平衡盐溶液，D-Hank’s 不含 Ca\(^{2+}\)、Mg\(^{2+}\)；PBS 以磷酸盐缓冲体系为主，两者应按实验所需离子与缓冲条件选择。Alsever 液中的 NaCl 提供主要渗透贡献，柠檬酸钠（sodium citrate）络合 Ca\(^{2+}\) 以抗凝，葡萄糖（glucose）提供代谢底物；实际 pH、渗透压、无菌性和配方版本均应记录。镜下应分别计数单细胞、二细胞融合、多细胞融合和破裂细胞，并报告完整视野的分母。

融合、拆合与经典功能分析¶

体细胞融合曾用于判断细胞表型的显性与隐性、定位人类染色体上的基因、制备杂交瘤和研究核重编程。人—鼠杂种细胞在传代中常选择性丢失部分人染色体，经典作图据“某人染色体是否保留”与“某表型是否存在”的共分离关系定位基因；现代 FISH、基因分型和测序提高分辨率，但不替代这条细胞遗传推理链。把间期细胞同 M 期细胞融合还可诱导 premature chromosome condensation，从 G\(_1\) 单线样、S 期粉末样和 G\(_2\) 双线样形态比较周期状态。

经典细胞拆合把有核细胞与胞质体分开后重新组合。细胞松弛素 B 可配合离心产生胞质体，早期资料也记载超声或短波光去核或使核失活；这些处理会损伤细胞骨架、膜和细胞器，必须以核染色、基因组 DNA、活性和胞质标志确认组分。显微操作与微量注射可把细胞核、细胞器、蛋白或核酸直接送入单细胞，注射体积、位置、机械损伤和操作员选择都是实验变量。

融合后的表型不能只同一个亲本比较。应包括两亲本、未诱导混合物、诱导但未融合群体、融合产物和适当选择对照，并明确异核体的短期读出与稳定杂种克隆的长期读出。亲本标志是否互补、染色体是否保留、目标表达是否恢复以及表型是否可传代，分别回答不同层次的问题。

功能扰动的时间尺度与对照¶

功能扰动可以来自配体、抑制剂、温度、缺氧和营养变化，也可以来自过表达、显性负效应、RNA 干扰（RNAi）、CRISPR 敲除、CRISPR 干扰／激活、条件重组或诱导性蛋白降解。急性药理处理适合捕捉分钟至小时尺度的活动，却可能有剂量相关脱靶；稳定敲除会触发克隆选择和长期补偿；RNAi 常只能部分敲低靶标，并受种子序列介导的脱靶作用和递送反应影响。方法选择应由问题所需的时间尺度、剂量关系、细胞耐受和因果层级决定，不把“新工具”当作旧方法的自动替代。

基线设计包括未处理对照、溶剂载体对照、仅递送试剂对照、非靶向试剂对照和已知阳性扰动。RNAi 至少使用多个独立序列，测量目标 mRNA 与蛋白，并以不被小干扰 RNA（siRNA）识别的功能性构建做救援；基因编辑使用多个向导 RNA 或独立克隆，验证目标位点、等位基因、表达、蛋白和表型，并以野生型回补或精确回复增强因果性。过表达和显性负效应构建要测表达量、定位与复合物计量。编辑构建和大片段／脱靶验证详见基因组编辑与验证。⁵

小分子实验还应测量细胞内靶点占有，或检测紧邻目标的生化步骤，建立完整浓度—时间关系，并用结构不同、作用于同一目标的第二种化合物或抗性突变作补充。单纯“处理后报告信号下降”不能区分目标抑制、细胞数减少、普遍转录／翻译抑制和检测干扰。

报告系统、筛选与结果交付¶

荧光蛋白、荧光素酶、酶底物、转录反应元件、定位转移和 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器把细胞事件转成可测信号。报告构建要说明启动子／反应元件、最小启动子、报告基因、降解标签、整合方式和克隆；启动子活性、mRNA、报告蛋白成熟与信号寿命之间存在时间滞后。双报告归一化能减少部分加样或转染差异，却可能因两个报告器共享转录资源、底物或处理敏感性而共同偏移。

化合物可自发荧光、淬灭、吸收激发／发射光，或直接抑制并稳定萤火虫荧光素酶；因此要使用不含报告器的亲本细胞、组成型报告系统、无细胞检测反应，以及采用不同读出原理的反筛。正交报告器在相同生物学控制下采用不同检测化学，能帮助识别技术特异假象，但阳性一致仍须靶点占有和功能救援证明机制。⁶

阵列式筛选让每孔对应一个扰动，便于形态和多参数读出；混合式筛选把扰动身份编码在向导 RNA 或分子条形码中，通过阳性选择、负选择或分选后测序比较输入与终点丰度。无论 RNAi、CRISPR 还是化合物库，都要维持文库覆盖、记录感染复数或递送效率、设置必需基因与非靶向对照、监测板位／批次效应并预先规定命中标准。初筛命中只生成候选，后续应以独立试剂、剂量—时间、靶点验证、正交表型和救援逐个确认。⁷

最终报告把细胞身份与批次、扰动实体及序列、递送和选择、时间剂量、样品回收、仪器与分析、全部对照、独立培养重复和未成功条件连在一起。死亡比例、融合率和报告信号都要保留分母与原始事件定义，使读者能判断结果来自生物学变化、样品选择还是检测系统。

参考资料与延伸阅读¶

• Galluzzi, L. et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation 25, 486–541 (2018).
• Galluzzi, L. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation 16, 1093–1107 (2009).
• Cossarizza, A. et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies, third edition. European Journal of Immunology 51, 2708–3145 (2021).
• Harris, H. & Watkins, J. F. Hybrid Cells Derived from Mouse and Man. Nature 205, 640–646 (1965).
• Davidson, R. L. & Gerald, P. S. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol. Somatic Cell Genetics 2, 165–176 (1976).
• Zimmermann, U. & Vienken, J. Electric field-induced cell-to-cell fusion. Journal of Membrane Biology 67, 165–182 (1982).
• Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods 3, 677–681 (2006).
• Auld, D. S. & Inglese, J. Interferences with Luciferase Reporter Enzymes. Assay Guidance Manual (2016; updated 2018).
• Costa, J. R. et al. Genome Editing Using Engineered Nucleases and Their Use in Genomic Screening. Assay Guidance Manual (2017).