色素、光合作用与呼吸实验¶

绿色叶片把光能转换成稳定化学能时，色素吸收、类囊体电子传递、整叶放氧和细胞呼吸处在不同的结构层级。把叶绿素从膜蛋白中提取出来，可以研究它的溶解、分离与光谱性质；让离体叶绿体还原人工受体，可以观察光驱动电子流；让叶圆片上浮或用碱液吸收 CO\(_2\)，则分别得到整片组织净产氧和呼吸放碳的代理读数。各实验相互衔接，并分别提供其对应过程的证据。

叶绿体色素的溶剂提取¶

陆生绿色叶片主要含叶绿素 a、叶绿素 b 和多种类胡萝卜素。叶绿素的二氢卟吩环含有中心 Mg\(^{2+}\)，植醇尾使分子能够嵌入膜内；类胡萝卜素也具有较强疏水性。叶片被研碎后，膜系破裂，有机溶剂便可把这些色素带入液相。提取物的颜色和吸收来自多种色素叠加，仍须经过层析或光谱解卷积才能分别讨论各组分。光合色素的结构与激发态去路提供了相应的生理背景。

经典定性实验称取约 2 g 新鲜菠菜叶片，洗净、吸去表面水并去除粗中脉，剪碎后与少量石英砂和 CaCO\(_3\) 一同研磨。先加入约 10 mL 无水丙酮形成匀浆，再加入约 15 mL 丙酮洗提，最后经脱脂棉、纱布、尼龙布或适合的滤材除去组织残渣。石英砂增加机械剪切，CaCO\(_3\) 缓冲组织酸化并减慢叶绿素脱镁；二者的加入并不保证所有色素都已定量回收。滤材用于截留颗粒，溶于提取剂的叶绿素分子随溶剂通过。

叶绿素会受酸、光、氧和温度影响。样品从切碎起便应统一时钟，在弱光和较低温度下尽快提取；若用于定量，可反复提取残渣直至预先规定的终点，并合并提取液。叶面水、提取比例、最终体积和残渣颜色都要记录。无水丙酮及后续层析溶剂易挥发、易燃，研磨、过滤和浓缩只在机构批准的局部排风与化学卫生程序下进行；敞口溶剂旁不得使用火焰、电吹风或其他可能点燃蒸气的设备。

色素混合物的纸层析¶

纸层析利用色素在流动相与纤维素固定相之间分配、吸附和解吸的差异。条形版本把滤纸剪成约 \(3\ \mathrm{cm}\times9\ \mathrm{cm}\)，在一端中央留下约 \(1\ \mathrm{cm}\times0.5\ \mathrm{cm}\) 的窄舌。用毛细管在窄舌上端中央点样，每次点样干燥后在原位重复约 7—8 次，使样带集中；展开槽中加入约 3—5 mL 经课程验证的展开剂，样点保持在液面以上，加盖并在避光条件下展开约 10 min。溶剂前沿接近规定位置时立即取出并用铅笔标记，随后记录条带颜色、宽度和中心位置。

圆形版本在一张圆滤纸中央开孔，以另一张约 \(4\ \mathrm{cm}\times2\ \mathrm{cm}\) 的滤纸卷成均匀纸芯，插入中央孔并接触培养皿中的展开剂。有些配方加入无水 Na\(_2\)SO\(_4\) 以维持较干的展开环境，是否采用及用量应随完整展开剂配方一同验证。色素样品点在中心周围而不落入进液孔，展开后形成同心色带。窄舌或纸芯使溶剂从较集中区域进入纸面，有助于减轻边缘前沿不齐，却不会消除纸张厚度、油污、折痕和缸内蒸气未平衡造成的展带差异。

条形层析的比移值写为

其中两个距离都从同一起点沿展开方向测量。常用非极性较强的展开体系中，胡萝卜素往往移动较远，叶黄素、叶绿素 a 和叶绿素 b 依次表现不同保留；具体次序和 \(R_f\) 取决于溶剂组成、含水量、纸张、温度和色素转化。可用纯标准、吸收谱或高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）保留时间进一步确认身份。操作中不以嘴吹干样点，也不以明火烘纸；展开容器保持封闭，废纸与展开剂按实际溶剂组成进入对应危废路线。

荧光、皂化与中心金属取代¶

取约 3 mL 较浓色素提取液，在透射光下主要看到溶液吸收后的绿色，在侧向或反射方向可见叶绿素的红色荧光。荧光表示一部分激发能以较长波长的光释放；在完整捕光复合体中，电荷分离、能量传递和热耗散会与荧光竞争，因此提取液的明亮荧光不能直接代表叶片光合效率。比较样品时应固定溶剂、浓度、光程、激发光和观察几何。

皂化实验可在观察过荧光的提取液中加入约 2 mL 20% 甲醇 KOH，充分混匀约 5 min，再沿管壁依次加入约 3 mL 乙醚和 4 mL 水，轻柔混合后等待分层。碱可水解叶绿素的植醇酯键，使较极性的叶绿素衍生物与许多未皂化类胡萝卜素表现不同相分配；某些类胡萝卜素酯和其他脂质也会被皂化，所以相层颜色只是化学性质证据。甲醇 KOH 兼具腐蚀性与可燃溶剂风险，乙醚高度易燃并可形成危险过氧化物，所有取用、混合、储存和废弃均须在合格通风橱内按试剂批次和机构标准操作程序（standard operating procedure，SOP）执行。¹

中心金属实验把两管各约 2 mL 提取液并置，一管作未处理对照，另一管加入数滴 5% HCl。酸使叶绿素失去中心 Mg\(^{2+}\)，形成偏橄榄褐色的脱镁叶绿素。加入少量醋酸铜可通过人工金属配位形成绿色衍生物，天然叶绿素并未由此复原。酸、铜盐、易燃提取剂和加热同处一管时风险显著，本科教学不在普通试管中加热这一混合液，也不封闭试管加热来控制挥发。金属取代示范须另行采用经机构风险评估的专门方案，明确通风、温度控制和压力释放。² 含铜有机废液单独收集。

叶绿素与类胡萝卜素的吸收定量¶

定量版本从约 0.5 g 去中脉的新鲜叶片开始，加入少量石英砂和 CaCO\(_3\)，以总计约 10 mL 的 80% 丙酮在冰浴、弱光下研磨，暗处静置约 10 min。滤液可转入 100 mL 容量瓶并以 80% 丙酮定容；这个十倍稀释会直接进入最终结果，应完整记录，若吸光度因此过低则须在正式测定前验证提取体积和可报告范围。提取液混匀、澄清后装入 1 cm 且与丙酮相容的比色皿，以同批 80% 丙酮作溶剂空白。

在与系数相匹配的波长和仪器分辨率下，可读取约 663、646 和 470 nm 的吸光度。Wellburn 针对 80% 丙酮和特定光谱带宽给出的一组方程为：

\(C_a\)、\(C_b\) 和 \(C_{x+c}\) 分别为叶绿素 a、叶绿素 b 及总类胡萝卜素浓度，单位为 \(\mathrm{\mu g\,mL^{-1}}\)。类胡萝卜素式中的分母 229 不可省略，否则结果会被放大两个数量级以上。系数与溶剂、精确波长和仪器光谱带宽相绑定；80% 丙酮、无水丙酮、甲醇或二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的方程不能混用，663 与 663.2 nm 等设置也应与采用的原始方法一致。Wellburn 的实验还显示，不同分辨率仪器使用不匹配的方程会产生系统差异。³

若提取液总体积为 \(V\) mL，另有稀释倍数 \(D\)，起始鲜质量为 \(m\) g，则某色素的鲜质量含量可写为

测量 710 或 750 nm 可监视颗粒散射。将该读数低于叶绿素 a 峰吸光度的 5% 作为重澄清判据时，应把它声明为本方法预先规定的质量界值；颗粒明显时应重新过滤或离心，并保留处理前后的读数。重复提取回收、溶剂空白、配对比色皿、吸光范围和稀释平行性共同决定定量质量。混合光谱法给出操作性总量，若需分辨叶黄素、\(\beta\)-胡萝卜素和其他单体，应采用经标准品确认的 HPLC。⁴

离体叶绿体的 Hill 反应¶

Hill 反应把水氧化与人工电子受体还原连接起来。活性类囊体在光下由光系统Ⅱ（photosystem II，PSII）从水取得电子并释放 O\(_2\)；2,6-二氯酚靛酚（2,6-dichlorophenolindophenol，DCPIP）接受电子后，其近中性条件下的蓝色氧化态转为近乎无色的还原态。酸性 DCPIP 可呈粉红色，须与正常的还原褪色区分。Hill 的经典实验由离体叶绿体在光下放氧建立了光反应可以与 CO\(_2\) 固定分离的证据，DCPIP 版本则把电子受体还原转成可见读数。⁵

一种制备从约 8 g 洗净、吸干的菠菜叶片开始，加入 10 mL 预冷提取液迅速研磨约 30 s，再加入 15 mL 同一提取液继续匀浆，经双层纱布过滤。滤液先低速离心约 3 min 去除粗碎片，再以较高速度离心约 8 min 收集绿色沉淀，并将其重悬于约 20 mL 提取液中冰浴保存。离心条件须以经当前转子换算和验证的相对离心力（relative centrifugal force，RCF）表示，并记录转子、半径、温度、制动与实际离体时钟。提取液还须明确缓冲组分、pH 和维持叶绿体渗透完整性的溶质；绿色沉淀只说明叶绿素富集，膜完整性和 Hill 活性要分别验证。

定性观察可把 5 mL 叶绿体悬液与 5 mL 0.1% DCPIP 混合，一管照光、一管遮光，5—10 min 后比较颜色。定量设计至少包括活性叶绿体＋DCPIP＋光、活性叶绿体＋DCPIP＋暗、热处理叶绿体＋DCPIP＋光，以及活性叶绿体但不加 DCPIP 的样品本底，分别识别光依赖反应、非生物褪色和叶绿体散射。热处理版本可采用沸水浴约 15 min 的教学条件，但处理后的蒸发损失要用相同缓冲液恢复至原体积，且不能把它与活性管的温度历史混淆。

在 620 nm 连续或按固定间隔读取吸光度时，先在暗中混匀并取得时间零点，再用测得光子通量密度的照明装置照射；仅记录灯功率和灯距无法跨灯具给出相同光量，还可能造成不同升温。可从每分钟一次、连续 5—6 次读数开始，正式斜率取初始线性区，并用同批样品本底和暗反应校正。叶绿体量以同一提取法测得的叶绿素质量或经验证的蛋白量归一化，教学相对活性可写为

若要换成 DCPIP 物质的量速率，还要在当前 pH、温度和波长下测定或采用相容的摩尔吸收系数，并计入实际光程和反应体积；DCPIP 的吸收系数具有明显条件依赖性。⁶ 这个速率反映离体制备中可到达人工受体的光驱动电子传递；CO\(_2\) 同化率和整叶净光合作用需由相应的独立方法测量。氧电极、脉冲振幅调制（pulse-amplitude modulation，PAM）叶绿素荧光和完整叶片气体交换提供的是不同的正交层面。

叶圆片上浮与净产氧¶

叶圆片的细胞间隙原本含有空气，因此会浮在液面。用无机碳溶液真空浸润后，液体替代大部分气体，圆片下沉；照光时光合放出的 O\(_2\) 逐渐进入细胞间隙并提高浮力，达到几何和密度阈值后圆片上浮。组织同时呼吸并消耗 O\(_2\)，所以浮起时间反映给定条件下的净产氧、气体积累和浮力阈值，而不是单独的总光合速率。Steucek 与 Hill 的经典叶盘法正是以这种可见转换比较光合处理。⁷

可用打孔器制备 60 枚面积一致的叶圆片，置于注射器中吸入约 20 mL 液体，排尽残余空气后封住出口，反复轻拉活塞，直至多数圆片稳定下沉；随后在黑暗中保持浸润状态，按每组 10 枚分装，观察 30 min 内的上浮。反应液宜使用含已知浓度 NaHCO\(_3\) 的缓冲液提供可重复的无机碳，并加入经预试确定、只够改善润湿的微量表面活性剂；清水组作为无外加无机碳对照。抽负压时间和幅度应统一，过强或过久会损伤组织。圆片避开主脉、来自相近叶位，分组前随机分配；独立叶片或植株才是生物重复。

每分钟记录浮起数比只记 30 min 终点保留更多信息。以一组圆片中 50% 上浮所需时间定义 \(ET_{50}\)，可在累计上浮曲线上插值得到；\(1/ET_{50}\) 可作为条件一致时的相对速率指标。若 30 min 内未达到 50%，结果属于右删失，不能把未浮圆片随意记作 30 min。深浅、容器、液温、光谱、实际光子通量、NaHCO\(_3\) 浓度、pH、圆片厚度、浸润程度和摇动都会改变读数。光照—黑暗与有—无 NaHCO\(_3\) 的组合对照有助于识别非光驱动浮起、组织呼吸和无机碳限制；需要绝对 O\(_2\) 通量时应改用校准氧传感器。

小篮子法与呼吸放碳¶

小篮子法把植物材料悬在密闭呼吸瓶内，以瓶底 Ba(OH)\(_2\) 吸收 CO\(_2\)：

反应消耗的 Ba(OH)\(_2\) 由标准草酸反滴定剩余碱量得到。空白瓶没有呼吸材料，保留更多 Ba(OH)\(_2\)，因而达到相同终点时消耗的草酸体积较大；样品与空白的滴定体积差对应测量期间捕集的 CO\(_2\)。这是一条“组织放碳—气相传质—碱液捕集—反滴定”的完整测量链，任一环节的泄漏或不完全反应都会改变结果。

可分别称取约 10.0 g 发芽小麦种子和 10.0 g 煮沸种子，以纱布包裹后悬在瓶内，在每瓶底部加入约 20 mL Ba(OH)\(_2\) 溶液并立即封闭。装置的通气孔若保留，应由碱石灰去除进入空气中的 CO\(_2\)，同时保证各瓶气流阻力相同；若作为完全闭式瓶，则须验证 30 min 内 O\(_2\) 不成为限制。每 10 min 轻柔混合一次可打破 BaCO\(_3\) 表膜并促进吸收，约 25 min 后加强但仍避免碱液接触种子，30 min 时移出材料并继续在封闭状态下轻摇数分钟，使瓶内 CO\(_2\) 尽量完成吸收。绿色材料测呼吸时必须避光，避免光合 CO\(_2\) 吸收改变净值。

至少设置无组织装置空白、活种子样品和经过验证的失活种子对照，并为每类准备独立瓶。失活材料可显示组织带入的酸碱物质、初始气体和非生物变化，但煮沸也会改变组织含水量与可溶物泄漏，不能替代无组织空白。全部预定对照都应完成滴定，任何偏离必须如实记录并按方案判定该批结果是否可用。

若草酸滴定剂的 CO\(_2\) 当量为 \(F\ \mathrm{mg\,mL^{-1}}\)，空白和样品体积分别为 \(V_0\)、\(V_1\)，材料质量为 \(m\) g，时间为 \(t\) h，则

\(F\) 必须由草酸的实际标定浓度和化学计量推出，不能只写成“1 mL 草酸相当的 CO\(_2\) 毫克数”而不说明数值来源。例如 0.0500 mol/L 草酸与 Ba(OH)\(_2\) 按 1∶1 反应时，1.00 mL 草酸对应 2.20 mg CO\(_2\)。滴定终点、指示剂、温度、Ba(OH)\(_2\) 实际浓度、瓶体积和密封性都应预先固定；同组滴定值接近只能说明精密，并不证明空白、计量式或捕集效率正确。滴定的通用测量链可用于检查标定、空白和终点误差。

Ba(OH)\(_2\) 是强碱，且可溶性钡具有急性毒性；草酸也具有腐蚀与系统毒性风险。材料必须与吸收液物理隔离，配液、加液、滴定和含钡沉淀废弃均按机构 SOP 在适当工程控制和个人防护装备（personal protective equipment，PPE）下进行，含钡废物不得进入普通排水。⁸ 现代红外 CO\(_2\) 分析仪可在短时闭式或受控流通系统中连续记录气体浓度，氧电极或光学 O\(_2\) 传感器则直接追踪耗氧；它们仍需控制温度、流量、腔体混合、泄漏、样品质量和信号线性。⁹

实验单位与结果解释¶

四组实验的主要结局应在操作前写清：层析记录条带及条件依赖的 \(R_f\)，光谱法报告溶剂和方程定义下的色素浓度，Hill 反应报告离体叶绿体对人工受体的初始还原速率，叶圆片法报告累计上浮曲线或 \(ET_{50}\)，小篮子法报告空白校正的 CO\(_2\) 释放量。一次提取的多个吸光度、同一叶片的十枚圆片或同一叶绿体制备的多管读数都是嵌套技术观察；独立叶片、独立植株或独立种子批才承担生物重复。

光照实验同时记录光源光谱、样品位置的光子通量密度和温度，气体实验记录腔体体积、环境组成、封闭时间与材料含水状态。所有计算从未经挑选的原始吸光度、上浮时序和滴定读数开始，保留空白、稀释、归一化和排除步骤。色素含量、电子受体还原、净产氧与呼吸放碳回答的是相邻而不同的问题；把这些代理量按结构层级连接起来，才能从经典现象走向对光合作用和呼吸作用的可检验解释。

参考资料与延伸阅读¶

Taiz L, Zeiger E, Møller IM, Murphy A. Plant Physiology and Development. 6th ed. Sinauer Associates; 2015.