分离、层析与蛋白质制备¶

从组织、细胞或培养上清中取得一种可用的蛋白，通常要连续改变样品的物理状态：先释放目标蛋白并移去颗粒，再利用溶解度、大小、电荷、疏水表面或特异配体降低复杂度，最后换入适合测定或保存的缓冲液。每一步都可能同时带来富集、稀释、失活、聚集和选择性损失。因此，蛋白制备需要依据目标状态、分离原理、处理规模和最终用途组织连续步骤，并维持一条可追溯的物料链。

经典训练依次涵盖细胞破碎、盐析、透析、离子交换柱分段收集、Bradford 追踪和氨基酸二维薄层层析，并把澄清、柱效、回收率、膜蛋白稳定和身份判读纳入同一流程。分离机制的理论比较见蛋白质研究方法，蛋白总量和标准曲线见光谱测定与生化定量，活性单位、比活力与初速条件见酶活性测定与动力学。

制备目标与物料链¶

目标分子与最终用途¶

设计流程时先写明需要保留的分子形式。一个基因产物可能同时存在可溶单体、寡聚体、膜结合形式、带辅基形式、不同修饰形式和降解片段；“目标蛋白”若没有状态定义，后续的高纯度仍可能对应错误物种。用于酶动力学的样品应保留催化活性和必要辅因子，用于结构研究的样品还要重视单分散性、装配与构象稳定，用作免疫原或定量标准品时则可能更重视身份、浓度和批间一致性。¹

一条完整物料链从起始材料开始，逐级记录裂解液、澄清上清或沉淀、流穿液、洗涤液、各洗脱馏分、合并池和最终制剂。某一步若“目标没有出现在洗脱峰里”，只有保留流穿和洗涤样才能判断它是没有结合、提前漏穿、留在颗粒沉淀中，还是在处理中失活。分离步骤的输出既是下一步的输入，也是解释损失发生在哪里的证据。

缓冲液、温度与处理时钟¶

提取缓冲液应同时满足目标蛋白稳定和下一步分离兼容。pH 决定许多表面基团的质子化与净电荷，盐浓度影响静电屏蔽、溶解度和离子交换结合，甘油、配体、金属或还原剂有时能稳定特定构象，也可能妨碍后续显色、固定化金属亲和或巯基反应。蛋白酶抑制剂需要覆盖样品中实际存在的酶类；EDTA 会抑制金属蛋白酶，也会螯合目标金属和金属亲和介质所需离子。

低温、缩短操作时间和降低气液界面暴露常有利于减少降解与聚集，但“全程冰上”也不是所有蛋白的固定答案：某些蛋白在低温更易沉淀，去污剂可能发生相变，黏度升高又会减慢过滤和传质。开发阶段应把样品温度、离开受控条件的累计时间、混匀方式和反复冻融次数列为实际变量，而不是只记录冰箱设定值。Cytiva 的样品制备资料把提取、澄清、去除干扰物、浓缩和缓冲液置换视为相互衔接的单元操作，强调每个单元都要围绕下游分析选择。²

从生物材料到澄清提取液¶

破碎方式与释放选择性¶

细胞破碎的对象是细胞壁、质膜或组织结构，选择方法时要同时考虑材料强度、目标所在区室、样品体积、发热、剪切和随之释放的杂质。高压匀浆、研磨、珠磨、超声、冻融、渗透压冲击和酶法各有不同作用方式，其适用范围由材料、规模和目标分子状态共同决定。

蛋白酶 K 会广泛水解蛋白质，不适合用于制备完整目标蛋白。细菌细胞壁可按物种选用溶菌酶等工具，植物和真菌则需考虑细胞壁组成；任何酶法都要确认目标蛋白是否会成为底物。超声和高压匀浆的强度应由能量输入、处理时间、温升、释放率和目标完整性共同描述，跨设备迁移时需要重新确定这些参数。膜蛋白制备手册也指出，破碎方法会改变膜片大小，随后用于回收膜组分的离心条件必须随之优化。³

澄清、核酸黏度与保留相¶

破碎液中同时存在未破碎细胞、细胞壁碎片、膜片、核酸、可溶蛋白和聚集体。低速离心或深层过滤常用于移去大颗粒，随后是否继续高速离心取决于目标：可溶蛋白通常保留澄清上清，膜蛋白可能保留膜沉淀，包涵体也常在沉淀中富集。转速每分钟转数依赖转子半径，报告离心条件时应使用相对离心力、时间、温度和转子信息，并明确保留上清还是沉淀。

高分子核酸会使裂解液拉丝、阻塞过滤器并增加非特异结合。可通过控制破碎、核酸酶处理或其他相容方式降低黏度，但核酸酶所需金属、加入的盐和核酸酶蛋白本身都会进入样品。澄清前后分别测定目标信号、总蛋白和浑浊度，可以区分“杂质被移除”和“目标随颗粒丢失”。过滤膜材质、孔径和预润湿方式还会影响低浓度蛋白吸附；昂贵样品应先用小量回收试验选择材料。

粗分级、脱盐与浓缩¶

盐析与选择性沉淀¶

盐析利用高盐条件下蛋白溶解度差异进行浓缩和粗分级。硫酸铵因溶解度高、离子强度大而常见；实际操作通常在受控温度和 pH 下缓慢加入，充分混匀并达到平衡，再离心分别保留沉淀和上清。所谓“30%—60% 饱和度级分”表示目标在这段盐饱和度变化中进入的相，不是一次把盐加到 60% 后只看沉淀。不同温度下的饱和浓度和加入体积不同，应按实际表格或计算工具配制并记录最终体积。

盐析常能保留一部分天然活性，却仍可能使蛋白不可逆聚集；沉淀重悬困难时，继续提高盐也未必提高纯化效果。等电沉淀、聚乙二醇沉淀、有机溶剂沉淀、酸沉淀和热处理各自改变电荷、水化或构象，适用性由目标稳定性和用途决定。盐析、低温乙醇或等电沉淀可能在特定条件下保留天然构象，实际结果仍需由沉淀后的活性、可重溶比例和聚集状态重新测量。

透析、超滤与快速脱盐¶

透析让盐、缓冲组分和其他小分子沿浓度梯度跨半透膜扩散，蛋白主要留在样品室。更换外液可重新建立梯度，因此多次换液比一次无限延长更有效。膜的标称截留分子量（MWCO）表示经验保留范围而非精确孔径；蛋白形状、膜材质、吸附、样品体积与外液体积都会改变回收。透析通常完成换液而不主动浓缩，样品还可能因渗透效应增减体积。⁴

超滤利用压力或离心力驱动溶剂和小溶质进入滤液，目标大分子留在截留液中，因而可同时浓缩；向截留液反复补加新缓冲液并继续超滤即为洗滤或渗滤。浓差极化、膜面结垢和非特异吸附会降低通量和回收，过度浓缩还会诱发聚集。离心浓缩器的最终体积、转子方向和最大离心力遵循器件说明，不能以“转到几乎干”为终点。

小型体积排阻脱盐柱用固定缓冲液把排阻在孔外的大分子先洗脱，小分子盐随后洗脱，速度快但受上样体积和样品稀释限制。选择透析、超滤或脱盐柱时，应根据目标分子与待去除物的尺寸差、是否需要浓缩、可接受时间和蛋白稳定性决定，而不是把三者视为同一操作的不同器材。

柱色谱的共同操作链¶

装柱、系统体积与柱床状态¶

层析柱的分离从均匀柱床开始。填料浆液应按介质说明彻底重悬并脱除气泡，在规定流速或压力下装填；裂缝、气泡、倾斜界面和局部压实会造成旁路、峰展宽和重复性下降。连接管路先充满相容液体，再以液滴相接或其他无气接法连接，避免把空气推入柱床。柱上筛板、接头、阀和管路还构成柱外体积，小柱和窄峰尤其容易被这些体积稀释。

柱床体积（column volume，CV）是组织平衡、洗涤和梯度的共同尺度；流速宜报告为 mL/min、线速度或 CV/h。滴速受滴头几何、表面张力和液体性质影响，“20 滴为 1 mL”仅可作为当场校准后的计数辅助，实际体积仍由量器测定。流速过高会增加压力并缩短传质时间，过低则延长实验并增加纵向扩散；最佳值由填料粒径、柱长、黏度和所需分辨率共同决定。

填料在运行中应始终被相容液体覆盖，避免柱床干裂或被强力加样冲起。储存液、清洗液和再生液依介质而异；所谓“再生”是恢复结合容量和可重复状态，常包含洗去强结合物、清洁、重新平衡和按说明储存，并非简单再过一遍起始缓冲液。Cytiva 的纯化手册把装柱均匀性、除气、最大压力、柱体积和介质专用清洗条件列为方法转移的必要记录。⁵

平衡、上样、洗涤、洗脱与分段收集¶

柱色谱的基本顺序可以写成“平衡—上样—洗涤—洗脱—强洗／再生—再平衡”。平衡使柱内 pH、盐、添加剂和检测基线达到稳定；上样液的组成应与结合条件相容，并预先澄清，必要时过滤。结合型步骤要保留流穿液判断容量和漏穿，洗涤阶段则在目标仍被保留的前提下尽量移走杂质。洗脱可用连续梯度或分段跃迁改变竞争离子、pH、配体或溶剂强度。

分段收集不应只按管号记录。每管还要对应实际体积、累计 CV、开始与结束时间、检测信号和收集延迟；人工移动试管架时，出口到收集管之间的死体积会让检测峰与实际馏分错位。自动或手动运行都应保存压力、流速、UV 或其他在线信号、梯度组成和电导／pH。峰宽、拖尾和前伸可能来自过载、慢传质、非特异吸附、柱床缺陷或管路体积，不能只凭一个峰顶决定合并范围。

离子交换层析¶

交换剂、结合条件与洗脱¶

离子交换层析依赖蛋白表面电荷与带相反电荷的固定基团可逆结合。阴离子交换剂自身带正电并结合带负电的蛋白，阳离子交换剂自身带负电并结合带正电的蛋白。强／弱交换剂描述固定基团在不同 pH 下维持电离的范围，不表示结合力必然强弱，也不表示蛋白质只能使用弱交换剂。强交换剂可在较宽 pH 范围保持电荷；弱交换剂的选择性有时会随 pH 改变，二者都可用于生物大分子。

当缓冲液 pH 高于蛋白表观 pI 时，蛋白通常趋向负电，可先试阴离子交换；pH 低于 pI 时通常趋向正电，可先试阳离子交换。真实结合还取决于局部电荷斑块、构象和盐屏蔽，因此 pI 只是筛选起点。盐梯度通过竞争和屏蔽静电作用洗脱，pH 梯度则改变蛋白或介质电荷；具体升降方向取决于交换剂、蛋白稳定区和希望改变的质子化状态，不能把“阳离子柱一律从低 pH 到高 pH、阴离子柱反向”写成固定规则。⁶

缓冲离子本身也可能与介质竞争。起始缓冲液要让目标稳定、具有适当电荷并保持足够低的电导，同时避免强烈结合介质的反离子和会沉淀或腐蚀系统的组合。上样量超过动态结合容量时，目标会在流穿中漏出；增加柱床并非唯一办法，也可降低上样量、调整 pH／电导或改用目标流穿而杂质结合的负纯化模式。

教学柱的分段追踪¶

一套教学实验先以蒸馏水洗柱 5 次、每次 1 mL，并留取 1 mL 为 A 管；再用 pH 4.0 柠檬酸缓冲液冲洗，待流出约 5 mL 后上样 0.1 mL 蛋白混合液。随后每次加入 1.0 mL pH 5.0 柠檬酸缓冲液，连续收集 B1–B9；再以水洗 5 次、每次 1 mL，收集 C1–C2；以 30% NaCl 每次 1 mL 洗脱 8 次，收集 D1–D8；最后再以水洗 5 次并收集 E1–E2。各管用 Coomassie Brilliant Blue G-250／Bradford 法在约 595 nm 追踪蛋白，并以 A 管作试剂背景。这个序列完整展示了柱前背景、平衡、上样、未结合组分、弱结合组分、强盐洗脱和柱后检查之间的关系，管号与每次收集动作都应保留在实验记录中。

这套教学链需要按实际介质与样品校准。水洗和 pH 4–5 柠檬酸缓冲液是否适合取决于介质和蛋白；高达 30% 的 NaCl 接近极高离子强度，可能超出所用蛋白、填料或设备的合适范围，应以厂家允许范围和预实验选择能洗脱目标的最低有效浓度。两次“水洗 5×1 mL”与“收集两个 2 mL 管”之间各有 1 mL 去向未写明，实施时必须逐管记录真实体积，以维持物料链闭合。每管体积用量器具核定，出口始终对准标记管；样品沿柱壁小心加入，待样品刚进入柱床后再补起始缓冲液，补液不得冲动界面，液面接近柱床时及时续加，不能让填料暴露空气。

Bradford 曲线给出各馏分的总蛋白信号，却不能区分目标蛋白和杂质。若目标是酶，应同步测各管活性；若有特异抗体、吸收特征或质谱方法，可再定位身份。合并馏分时同时看目标信号、杂质、活性和峰形，而不是把所有显蓝的管合在一起。A 管空白也须与各馏分的缓冲背景匹配；pH 和盐差异可能改变染料响应，必要时为不同缓冲阶段另设基质空白或先统一换液。

其他蛋白色谱方式与流程组合¶

高选择性亲和步骤适合捕获低丰度目标，离子交换和 HIC 具有较高容量并能移去大量异质杂质，SEC 常在样品已浓缩且体积较小时用于精制、除聚集体和换液。连续两步若依赖相同性质，新增分辨信息可能有限；把亲和、电荷、疏水性和尺寸等相对正交的选择性组合，通常更容易清除不同类型杂质。每增加一步都会带来回收损失，流程长度应由用途需要的纯度和状态决定，而不是以步骤多寡表示严谨。⁷

膜蛋白与难溶蛋白的制备¶

整合膜蛋白的大面积疏水表面原本接触脂质，破膜后需要去污剂胶束、脂质颗粒或其他膜模拟环境屏蔽。首先分离膜组分再增溶，有利于减少可溶蛋白背景；直接在澄清或未完全澄清裂解液中增溶则可缩短流程，但会把更多脂质、核酸和颗粒带入下游。去污剂筛选应同时比较溶出比例、单分散性、复合物装配和功能，强力溶出并不自动等于正确折叠。

去污剂必须在结合、洗涤、洗脱、浓缩和最终分析中维持足够浓度；透析或稀释低于可维持溶解的条件会使蛋白聚集。固定化金属、离子交换和 SEC 的表现还会受蛋白—去污剂—脂质复合颗粒的整体电荷和尺寸影响。纳米盘、Saposin 脂质颗粒、peptidisc 和 SMA 类脂质颗粒可在不同程度上恢复或保留脂质环境，却各自带来颗粒大小、脂质选择、聚合物兼容和两侧可接近性差异，应把采用的膜模拟体系视为样品组成的一部分。⁸

包涵体或其他难溶聚集物的处理目标不同。离心富集到的包涵体仍可夹带膜片、核酸和细胞壁，强变性剂溶解后得到的是待复性多肽，不是已经恢复功能的蛋白。复性结果应由可溶回收、单分散性、二级／三级结构和活性共同验证；只在离心后进入上清，不能证明正确折叠。

纯化表、合并判断与制剂质量¶

对酶制备，每一级分至少记录体积、蛋白浓度、总蛋白、活性浓度、总活性和比活力。若第 \(i\) 步的总活性为 \(A_i\)、总蛋白质量为 \(P_i\)，起始值为 \(A_0\) 和 \(P_0\)，则

总活性依赖各级分均在相同、已验证的初速条件下测定；总蛋白则须使用与缓冲液相容的定量方法。回收率超过 100% 可能来自抑制物被移除、酶被激活、不同基质的测定偏差或体积／稀释记录错误，不应自动改回 100%。比活力上升而目标条带减少，可能表示非目标酶贡献了活性；条带变纯而活性下降，则可能是目标失活或辅因子丢失。

最终合并池应按用途确认身份、纯度、均一性和功能。SDS-PAGE 可显示主要多肽链，SEC 可观察大小异质性，质谱可确认分子身份与部分修饰，活性测定则检验规定条件下的功能；这些证据不能相互替代。保存记录还包括制剂浓度、缓冲液、添加剂、分装体积、冻存或冻干条件、冻融次数和储存后的复测结果。结构基因组学的大规模经验同样表明，表达构建、纯化标签、稳定性筛选和质量控制是连续开发过程，单一通用流程无法保证每个蛋白都得到正确样品。¹

氨基酸二维薄层层析¶

薄板、点样与二维展开¶

薄层层析把微晶纤维素、硅胶等固定相铺在玻璃、铝或塑料支持物上，流动相借毛细作用沿薄层移动。一套教学方案洗净并烘干一块 15 cm×15 cm 玻璃板，以 4 g 微晶纤维素和 15 mL 0.3% 聚乙烯醇溶液调成匀浆，通过前后倾斜玻璃板铺成连续薄层，再水平放置干燥。这组数量可作为该教学板的起始配方，实际层厚和均匀度仍须观察。石膏、淀粉、聚乙烯醇和羧甲基纤维素盐都可作为不同体系的粘结材料，但配方会改变孔隙、吸附和展开速度，应把板批次、厚度、干燥条件与边缘缺陷记入原始记录。

样品在距两边和溶剂液面足够远的原点处少量多次点加，每次完全干燥后再加下一份，使总量增加而斑点仍小。对于 15 cm 薄板和毛细点样，“5–10 mL”显然与装置尺度不相容，实际体积通常在微升级，并由毛细管、样品浓度和薄层承载量共同确定；缺少原始实验记录时不指定唯一数值。水可以作为部分样品的溶剂，但高含水量、盐和大体积会占据固定相、造成原点扩散或改变后续分配，应选能溶解样品、易挥发且与展开体系相容的最小体积。

二维展开先让第一种流动相沿一个方向分离，取出后立即标记溶剂前沿并彻底除去流动相，再将薄板旋转约 90°，以选择性不同的第二种流动相展开。原实验以碱性体系和酸性体系形成两向选择性：溶剂升至距板顶约 1.5 cm 时取出，以冷、热风交替除去溶剂，并在同一流动相中重复展开至原前沿；酸相展开前按原配方把显色液加入展开剂，干燥后观察斑点。这套“先碱后酸、重复展开并随第二相显色”的顺序可作为具体教学配方保留；现代方法也常在两向分离全部结束后再喷洒或浸渍茚三酮，以免显色反应提前改变保留。关键是两种体系提供互补分辨，并按采用的显色方式设置标准，而非所有氨基酸混合物都必须使用同一顺序。第一向残留溶剂会进入第二向、改变斑点形状和保留，因此两向之间充分干燥是操作链的重要节点。

软板缺少牢固支持，搬动和垂直展开容易破坏薄层，常采用水平展开；粘结牢固的硬板可使用上行、水平和二维等多种方式。无论哪种装置，展开缸要预先达到规定的气相平衡，溶剂液面不得淹没原点，薄板不应贴壁倾斜。展开至预定距离后先标记前沿，再在通风和相容的加热条件下除去溶剂；挥发性有机溶剂和显色试剂的工程控制见实验安全、伦理与风险管理。

\(R_F\)、显色与身份边界¶

平面色谱的迟滞因子 \(R_F\) 用同一方向上斑点中心迁移距离 \(b_i\) 与流动相前沿距离 \(b_F\) 的比值表示：

\(R_F\) 没有量纲，只在固定相、薄层厚度、流动相组成、温度、饱和状态和上样量相近时可比较。二维板应分别报告两个方向的坐标；斑点拖尾、过载、前沿弯曲或原点扩散都会增加定位不确定性。IUPAC 将它定义为平面色谱中的迟滞量，并区分柱色谱的保留因子，二者不能混用。⁹

茚三酮与许多游离氨基化合物反应，大多数一级 \(\alpha\)-氨基酸形成蓝紫色产物，脯氨酸等具有二级胺结构的氨基酸常呈黄色；颜色还受残基结构、试剂配方、温度、时间和水分影响。“脯氨酸黄色、其余蓝紫色”可作为该组标准品的观察线索，未知物身份还需结合迁移位置和其他验证。显色会消耗样品并可能改变斑点，因此需要后续回收或其他检测时，应保留未显色平行板或采用可定位的分区策略。经典纤维素薄层方法已用茚三酮显色并在受控条件下对氨基酸进行定量，说明颜色强度经过逐种标准校准后才能转成量。¹⁰

未知斑点与标准品在两向位置和颜色上相符，只支持“在该体系中共迁移且显色相似”。同板共点样、改变流动相、离子交换氨基酸分析、衍生化液相色谱或质谱可以逐步增强身份判断。复杂水解物中多个氨基酸可能仍重叠，盐、糖、有机酸和样品过载也会改变斑点；二维薄层层析的教学价值在于把点样、分配、前沿、正交选择性和显色证据连成完整观察链，而不是用一个 \(R_F\) 数值代替化学身份。

方法记录与结果交付¶

可复核的制备记录至少包括：起始材料来源和质量；目标分子形式与用途；每步缓冲液、温度、时间和添加剂；破碎设备与能量输入；离心的相对离心力、转子、时间和保留相；过滤膜与孔径；沉淀范围、透析／超滤膜及最终体积；柱、填料批次、柱床体积、流速、压力、平衡、上样、洗涤、梯度、馏分边界、检测延迟、清洁和储存；各级分的总量、身份、活性、回收率与纯度证据；所有合并、舍弃、返工和偏离决定。

交付一种“纯化蛋白”时，还应附上能够重建样品状态的最小信息：序列或构建边界、标签及是否切除、预期修饰和辅因子、缓冲液与浓度、主要纯度方法、聚集或寡聚状态、活性结果、批次、保存条件和已知限制。色谱图、薄层板照片、凝胶原图和计算表属于原始证据链；只留下最终一管无标签样品和一张裁切峰图，无法说明它从哪里来、损失了什么或适合回答什么问题。

参考资料与延伸阅读¶

• Structural Genomics Consortium et al. Protein production and purification. Nature Methods. 2008;5:135–146.
• Burgess RR. Overview of the purification of recombinant proteins. Methods in Enzymology. 2009;463:331–342.
• Cytiva. Protein sample preparation；Strategies for protein purification；Handbook library.
• Thermo Fisher Scientific. Protein clean-up technical handbook.
• IUPAC. Nomenclature for chromatography；retardation factor in planar chromatography.
• Young JW. Recent advances in membrane mimetics for membrane protein research. Biochemical Society Transactions. 2023;51:1405–1416.
• Clark ME. Simple, rapid quantitative determination of amino-acids by thin-layer chromatography. Analyst. 1968;93:810–816.