蛋白质电泳、印迹与免疫检测¶

蛋白质电泳把混合物转化为按迁移率排列的区带，印迹再把这些区带复制到便于探测的固相，抗体或总蛋白染料最终把某一类分子变成可见信号。三步各自回答不同问题：凝胶显示样品中有哪些迁移组分，转印显示哪些组分到达并留在膜上，免疫信号则显示所用抗体在这些位置识别了什么。只有把样品状态、分离、转移、抗体验证和成像范围连成一条证据链，条带强弱才能支持蛋白丰度或分子形式的比较。

蛋白质检测从分离、层析与蛋白质制备接过样品，沿手工灌胶、上样、染色、湿转、半干转、封闭和显色的经典操作路径进入现代定量与原始图像要求。电泳和抗体识别的机制全貌见蛋白质研究方法，微孔板的吸光与发光读数见光谱测定与生化定量。

从实验问题选择检测路线¶

“检测蛋白质”可以指总组成、表观分子质量、天然复合物、等电点、某一表位或溶液中的抗原浓度。方法必须与所要保留的分子状态相配。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）适合展开多肽链并比较表观相对分子质量；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）尽量保留非共价装配；等电聚焦（IEF）按表观等电点分离；蛋白质免疫印迹（Western blot）把迁移位置与抗体识别结合；酶联免疫吸附测定（ELISA）则牺牲迁移信息，以固相捕获和酶标读出换取较高通量。

实验设计应在上样前写明靶标的预期大小、异构体或加工形式、样品是否需要还原、抗体识别线性表位还是构象表位、结果用于定性还是定量，以及阳性、阴性和过程控制。若要比较处理组蛋白丰度，还要把生物学重复、泳道分配和跨胶参照提前纳入设计，不能等显影后再挑选内参或曝光。

SDS–PAGE 的迁移基础¶

SDS 包覆、还原与表观相对分子质量¶

十二烷基硫酸钠（SDS）以疏水链结合蛋白并使许多多肽展开，硫酸基则赋予大量负电荷。经典测量常引用约 \(1.4\ \mathrm{g}\) SDS／g 蛋白的高结合比；它描述一组蛋白在特定条件下的近似行为，不是每条多肽都严格遵守的化学计量。¹ 当电荷／质量比和延展状态近似相似时，聚丙烯酰胺网孔的阻力成为主要差异，较小多肽通常迁移较快。

二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇或其他相容还原剂使多数二硫键断开；非还原 SDS–PAGE 则省去还原剂，用于观察链间二硫键是否改变迁移物种。两者都已破坏许多非共价相互作用，因而“非还原”不等于“天然”。糖基化、强酸性序列、跨膜区、耐 SDS 折叠、不完全还原和共价修饰都可能使迁移偏离序列计算质量；膜蛋白的异常迁移已被证明与 SDS 结合量和残余构象有关。²

样品缓冲液通常同时提供 SDS、还原剂或其空白对照、密度成分、示踪染料和合适缓冲环境。加热有助于展开，却不能把“100 ℃、5–10 min”当成所有蛋白的固定步骤：某些膜蛋白、超大复合物或易聚集蛋白在强热下反而形成难以入胶的聚集体。先做温度与时间小试，并把还原与非还原样品并行处理，比观察异常条带后推测原因更可靠。

不连续缓冲体系的浓缩与分离¶

Laemmli 型体系把低浓度、大孔径的浓缩胶置于较高浓度的分离胶上方，并让两层凝胶与电极液具有不同 pH 和离子组成。浓缩胶中氯离子是迁移较快的前导离子，主要呈两性离子形式的甘氨酸移动较慢；带负电的蛋白—SDS 复合物被夹在两者形成的移动界面中，压缩成窄带。进入较高 pH 的分离胶后，甘氨酸负电比例和迁移率增加并越过蛋白，浓缩结束，网孔大小开始主导分离。Laemmli 1970 年的工作使这一不连续 SDS–PAGE 格式成为常用方法。³

连续 PAGE 让凝胶和电极液维持较一致的缓冲环境，样品从进入凝胶起便主要按自身迁移率和分子筛作用展开；不连续体系则有意建立前导／尾随离子和两层胶，先浓缩再分离。两者不是“低分辨率／高分辨率”的绝对等级，是否需要浓缩取决于样品体积、起始带宽和分析目标。

凝胶总单体浓度决定平均孔径，交联比例进一步改变网络结构；固定百分比凝胶适合较窄质量范围，梯度胶可在同一胶内展开较宽范围，小肽还可选用 Tris–tricine 等体系。凝胶百分比并不能脱离缓冲体系、交联度、胶厚和目标范围单独决定分辨率。样品量超过浓缩和分离能力时，即使“胶浓度正确”也会出现宽带、拖尾和相邻泳道串扰。

手工灌胶、上样与运行¶

聚合体系与教学配方¶

丙烯酰胺单体形成线性链，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺提供交联点。过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）产生引发聚合的自由基，四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）促进自由基形成并加快聚合。氧会猝灭自由基，因此分离胶灌注后常覆盖与配方相容的水或醇层，使液面平整并隔绝空气；聚合后必须完全移除覆盖液，再灌浓缩胶。化学聚合也曾以 APS 配合二甲基氨基丙腈等促进剂，光聚合可用核黄素体系；这些历史配方具有不同毒性、聚合速度和氧敏感性，需要按实际方法成套选择。

下列手工配方未注明 Acr–Bis、SDS 和 APS 储液浓度，所列体积之和也分别略超过名义的 4 mL 与 3 mL，因而只作为课堂版本的材料清单；复原实际单体百分比或移植到另一套玻璃板时还需补足这些参数。

可复现配方必须另外记录各储液的质量分数或摩尔浓度、Acr∶Bis 比、目标总单体浓度、制胶日期、胶厚和温度。先清洁并干燥玻璃板、垫条和梳子，按设备说明装配并检漏；配液时让 APS 和 TEMED 最后加入，混匀后立即灌注。分离胶预留梳齿和浓缩胶空间，聚合后去除覆盖液并吸净残液，再灌浓缩胶、垂直插梳，避免齿下气泡。未聚合丙烯酰胺具有显著健康危害，APS、TEMED、SDS、还原剂和染脱色溶剂也须按 SDS、通风和废物路线管理，具体控制见实验安全、伦理与风险管理。

聚合完成的透明凝胶具有一定机械强度，网孔可调，区带在支持介质中不易像自由溶液界面那样迅速扩散；聚丙烯酰胺基质的电渗通常也较低。这些性质解释了 PAGE 的微量、高分辨率优势，同时也说明气泡、聚合不完全、胶厚不均和单体比例错误会直接写入最终图形。

样品、标准与泳道¶

各样品先用与缓冲成分相容的方法测定总蛋白，并在预定动态范围内决定上样质量；等体积不代表等质量，等总蛋白也不保证目标蛋白落在线性范围。样品与浓缩样品缓冲液充分混合，按方案进行还原和加热，冷却后短暂离心，使不溶颗粒和管盖冷凝液不进入加样孔。盐、核酸和去污剂过多会增加黏度、导电率或沉淀，应在制备阶段控制，而不是靠更高电压强行跑开。

每块胶至少安排与目标范围匹配的蛋白标准泳道，并保存“样品编号—泳道—上样质量—体积—处理条件”的对应表。一套教学步骤使用 20 μL 上样并把最外侧孔一律弃用；实际孔容量和边缘效应取决于梳子、胶厚、散热和装配。先用缓冲液或对照样品验证边缘泳道，不能把一个装置的经验写成所有胶的禁用规则。枪头伸入孔口但不触碰孔底和胶壁，贴近液面缓慢排液，避免刺破胶、引入气泡或让高密度样品溢入相邻孔。

垂直槽上端／内槽通常接阴极、下端／外槽接阳极，蛋白—SDS 复合物向阳极迁移；某些教学槽的电极几何与命名不同，接线应以设备标识和示踪染料方向确认。内槽密封不良、缓冲液液面不足或绝缘部件未按说明移除会形成开路，表现为电压存在而电流极低。运行中记录恒压或恒流模式、实际电压电流、时间、缓冲液批次、液面和温升；焦耳热不均会造成弯曲带和分辨率下降。

染色、脱色与表观质量估计¶

电泳结束后可将凝胶固定、以 Coomassie 染色，再在摇动中分次换脱色液，直到背景允许可靠看带。一套教学方案采用室温染色约 1 h、约 80 r/min 摇动并每 20 min 换脱色液；这些时间和转速受胶厚、染液配方、容器与染色目标影响，实际方案应据此调整。灵敏度更高的银染或荧光总蛋白染料有不同线性范围和质谱兼容性，选择前要确定凝胶是用于纯度查看、定量还是切胶鉴定。

表观相对分子质量可由同胶标准建立校准。在线性分离区内，先计算蛋白相对迁移率

再拟合 \(\log_{10} M_r\) 与 \(R_f\) 的关系，并由目标条带插值。不能把凝胶两端压缩区外推，也不能用预染标准未经校准的标称位置做高精度估计；预染标签本身可能改变迁移。SDS–PAGE 给出的始终是相对于同胶标准的表观 \(M_r\)，蛋白身份和准确质量仍需抗体、质谱或序列证据。

其他蛋白电泳模式¶

非变性 PAGE 不加 SDS 和强变性条件，迁移率由净电荷、形状、尺寸和凝胶阻力共同决定。活性染色可以在胶内提供酶功能位置，电泳迁移率改变分析也可显示结合或装配变化；但一个慢带可能来自更大复合物、较低净电荷或形状改变，必须用标准、扰动和正交方法区分。

IEF 在固定或可形成的 pH 梯度中运行。蛋白在局部 pH 不等于 pI 时带净电荷并继续移动，接近 pI 时速度降低；扩散离开该位置又重新带电并被电场推回，因而形成聚焦。早期载体两性电解质梯度容易漂移，固定化 pH 梯度（IPG）提高了重复性。二维电泳先以 IEF 按表观 pI 展开，再将条带在 SDS 与还原／烷基化条件下平衡，沿垂直方向做 SDS–PAGE。一个斑点可能含共迁移蛋白，同一蛋白也可因修饰、加工或降解形成多个斑点；切胶质谱才能进一步归属。⁴

移动界面电泳直接观察自由溶液中折射率界面的移动，记录了蛋白电泳研究的历史路径，但相邻组分界面容易重叠。等速电泳把分析物夹在高迁移率前导离子与低迁移率尾随离子之间，形成相接且自调节浓度的区带，常用于预浓缩。毛细管电泳以细毛细管和高电场获得快速分离，观测速度是分析物电泳迁移与电渗流的合成；管壁状态、pH、离子强度和温度都会改变重复性。它们与板式 PAGE 共享“电场—迁移率—介质阻力”的基础，却不能把操作参数相互照搬。

琼脂糖凝胶孔径较大，除核酸外也可用于某些超大蛋白复合物、脂蛋白和病毒颗粒；分辨范围和染色方式与聚丙烯酰胺胶不同。若目标是完整复合物的大小和组成，原位活性、非变性 PAGE、蓝色原位 PAGE、琼脂糖电泳和体积排阻各保留不同层次的信息，应按样品而不是按技术年代选择。

从凝胶到膜的电转移¶

膜、孔径与转移方向¶

Towbin、Staehelin 和 Gordon 1979 年证明可把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白电转移至硝酸纤维素膜，再以抗体检测固定蛋白；他们同时指出 SDS 胶中的转移并非天然定量。⁵ 在常见阴离子 SDS 体系中，凝胶位于阴极一侧，膜位于阳极一侧，蛋白从胶迁向膜。若夹层方向反置，蛋白会离开凝胶却到不了膜，因此装夹前必须同时核对电极、胶和膜顺序。

硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC membrane）和聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride membrane，PVDF membrane）是常用蛋白质免疫印迹膜，尼龙膜主要用于核酸杂交和一些专门的带电固定体系。NC 和 PVDF 主要通过疏水等相互作用吸附蛋白；PVDF 的有机溶剂预润湿用于让疏水膜被水相缓冲液均匀浸润，而非生成正电位点。

0.45 μm 膜适合许多常规靶标，较小蛋白常考虑 0.2 μm 膜以减少穿膜；这只是起始选择。高分子蛋白需要充分离开凝胶，小分子蛋白又可能穿过膜，甲醇、SDS、缓冲体系、胶浓度、膜孔径、电场和时间必须联动优化。甲醇可促进某些蛋白留膜并减少 SDS，却会使凝胶收缩并妨碍部分高分子蛋白迁移；不能用“越多越牢”概括。

湿转、半干转与夹层装配¶

湿转把夹层浸在较大体积转印缓冲液中，常见顺序从阴极到阳极为“海绵—滤纸—凝胶—膜—滤纸—海绵”；缓冲容量和散热较好，便于为高分子蛋白延长或降温转移。半干转把滤纸—凝胶—膜—滤纸夹层直接置于平板电极之间，用液量少、路径短、速度快，但缓冲液耗尽、局部干燥和压力不均会更快暴露，低分子蛋白也可能在过强条件下穿膜。所谓“半干转不适合定量”不是绝对规则；只要均匀性、线性和回收经过验证，它也可用于定量，问题在于具体系统而非名称。

膜和滤纸按凝胶尺寸裁切，PVDF 按产品说明预润湿，所有材料再在相应转印液中平衡。装配时让每层完全贴合，用滚轮或洁净工具从一侧逐步排除气泡；膜与胶之间一个小气泡就会形成边界清楚的空白区。夹层厚度和滤纸含液量须均匀，不能用过度挤压换取贴合。转移过程中记录恒压／恒流模式、实际电流、时间、温度和冷却方式；高电流发热会改变缓冲液电导、蛋白结合和夹层状态。

转印完成后立即记录预染标准在膜上的位置，并以与后续检测相容的可逆总蛋白染色检查整膜。凝胶后染只能说明哪些蛋白仍留在胶中，不能证明离胶蛋白已牢固结合膜；膜上总蛋白图才同时暴露气泡、折皱、泳道形状和不均匀转移。Thermo Fisher 的技术手册也把膜上可逆染色列为转印后的质量检查，而不是把最终抗体条带当作唯一转移证据。⁶

封闭、抗体孵育与信号产生¶

抗体链与过程对照¶

封闭剂占据膜上尚未结合蛋白的表面，减少后续抗体直接吸附膜。脱脂乳、酪蛋白、BSA 和无蛋白配方各有适用范围；封闭剂本身可能含生物素、磷蛋白、免疫球蛋白或与抗体交叉反应的成分，过度封闭也可能降低靶表位信号。因此封闭不是浓度越高越好，而是为给定膜、抗体和检测化学寻找信噪比最高的条件。⁶

一抗识别靶标表位，标记二抗通常识别一抗宿主物种和免疫球蛋白类别，从而放大信号。多重荧光检测还要让一抗宿主、二抗交叉吸附和荧光通道彼此可区分。孵育时间、温度和稀释度须由滴定确定；洗涤通过时间、体积、去污剂和摇动移除游离抗体，洗涤不足会提高背景，过强又可能损失低亲和结合。膜在流程中是否允许干燥取决于膜和检测体系；除非方案明确利用干燥固定，常规水相免疫孵育应避免意外干膜和局部叠压。

“出现预期大小的一条带”只是一项身份线索。国际抗体验证工作组提出按具体应用组合遗传缺失／降低、与独立方法相关、独立抗体、带标签蛋白表达及免疫捕获—质谱等策略。⁷ 一个严谨的 Western 实验可按问题配置以下控制：

• 已知表达和不表达靶标的生物材料，检验样品背景；
• 靶基因敲除或敲低，检验条带是否随靶标消失或下降；
• 识别另一表位的独立抗体、标签抗体或质谱，提供正交身份证据；
• 无一抗、仅二抗或检测底物空白，定位二抗、膜和成像系统背景；
• 非还原／还原、去糖基化、磷酸酶处理或竞争肽等机制性处理，检验迁移形式，但每种处理都需自己的过程对照。

同型对照主要用于评估 Fc 相关或一般非特异结合，不足以证明 Western 一抗特异性。抗体供应商给出的“适用于 WB”也只说明某些测试条件下得到过信号；抗体批次、样品物种、剪接形式、固定或变性条件改变后仍要验证。

显色、化学发光与荧光¶

酶标二抗可把底物转为不溶有色产物或短暂发光产物。显色结果便于直接观察，但沉淀会随反应时间累积并较早失去定量线性；HRP–ECL 通过过氧化物氧化鲁米诺产生光，灵敏度高，却会因底物耗尽、HRP 过量、曝光饱和和时间衰减产生白心、反转或不可比信号。荧光二抗直接由激发—发射读出，便于多通道和较宽范围测量，但需控制自发荧光、串色、扫描增益和光漂白。

任何检测体系都先用样品系列或混合阳性样品建立“上样量—背景扣除信号”关系，并选取目标与归一化信号同时处在可报告范围的上样量。强条带的像素值未到软件上限也不保证反应链未饱和；曝光序列、底物时间和未处理图像应一并保留。不同膜、不同曝光或不同显影时间的原始强度不能未经跨膜参照直接相除。

固相免疫检测与 ELISA¶

Western 以凝胶迁移位置分开样品，斑点／狭缝印迹（dot/slot blot）则把样品直接点在 NC 或 PVDF 上，省去分离但丢失表观质量信息。酶反应生成不溶有色沉淀时，点的颜色可显示结合，相同位置的交叉反应则需要相应对照排除。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶是常用酶报告物；3,3′-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）经 HRP 催化形成棕褐色不溶产物，适合空间定位但须按危险化学品条件处置。放射免疫测定把结合转成同位素信号，保留了高灵敏历史路径，同时需要辐射许可、衰变校正和放射废物管理。

免疫荧光、免疫组织化学和免疫电镜保留空间信息，具体固定、表位修复、成像和伪影迁交组织学染色与细胞成像，需要采用与膜上检测不同的条件。HA 等短肽标签可由相应标签抗体检测，适合验证构建表达或纯化级分；信号证明的是带标签分子，标签对表达、加工和迁移的影响仍需对照，不能自动代表未标记内源蛋白。

ELISA 把抗原或抗体固定在微孔板等固相，用洗涤分隔结合与游离组分，再以酶标反应读出。Engvall 与 Perlmann 1971 年已用酶标体系定量免疫球蛋白 G，奠定了 ELISA 的定量路径。⁸

原微生物学素材的“双抗体夹心—洗涤—酶联检测抗体—底物”和“抗原包被—待检抗血清—酶联抗抗体—底物”顺序均保留在表中，同时纠正“洗除过量抗体”这类对象混写：每一步要明确洗去的是未结合的哪一种试剂。定量板需包含试剂空白、零标准、覆盖范围的校准物、重复孔和基质质量控制样；还要验证选择性、精密度、回收、稀释平行性、稳定性和可报告范围。FDA 的生物标志物方法指导强调这些性能应服务于预定用途，而非把一条漂亮标准曲线当成方法已经有效。⁹

定量、归一化与跨胶比较¶

定量 Western 至少包含三层检查：上样前总蛋白测量，转印后整泳道总蛋白或经验证的参照信号，以及目标条带的背景扣除强度。目标信号 \(S_i\) 可先除以同泳道归一化量 \(N_i\)：

这个比值只有在 \(S_i\) 与 \(N_i\) 各自处于动态范围、背景算法固定、膜上区域相对应时才有意义。GAPDH、β-actin 或 tubulin 丰度高，且会随组织、处理和细胞状态改变；使用前必须证明在本实验范围稳定且未饱和。整泳道总蛋白染色能同时显示上样和转移形状，多个研究支持其作为更稳健的归一化选择，但所用染料本身也要验证线性和兼容性。¹⁰

磷酸化蛋白常先以同一靶标的总蛋白信号解释“被修饰比例”，再用整泳道总蛋白或另一种经验证的上样参照处理样品量差异；只除以 GAPDH 无法区分总靶蛋白增加和磷酸化比例改变。若样本超过一块胶，应把同一混合参照样加载在每块胶的预留泳道，先在各膜内归一化，再借跨胶参照连接批次。将处理组集中放在一块胶、对照组集中放在另一块胶，会使生物效应与胶／转印批次完全混杂。

Taylor 等以定量 Western 流程说明，目标和归一化信号的线性范围、同膜测量、总蛋白图和跨膜参照都应在正式比较前建立。¹¹ 技术重复可描述制胶、转印和成像变异，却不能替代独立生物样本；统计单位仍由研究问题和实验设计决定。

从异常图形定位流程环节¶

故障排查应从最早可观察的节点开始：先看电流和示踪前沿，再看总蛋白胶，随后看膜上总蛋白，最后解释免疫信号。只看最终 ECL 图容易把制胶、上样、转膜和抗体问题混在一起。

气泡白圈、封闭或洗涤不良导致的高背景、封闭液颗粒形成的黑点、膜干燥造成的不均一背景，以及过载与抗体过浓造成的拖尾，都可沿这条诊断链定位；“哑铃状”等复杂图形则需要从凝胶、上样、转印和检测各层取证。

原始图像、记录与结果交付¶

每次实验至少保存样品来源和处理、裂解与抑制剂、总蛋白测定方法、还原／加热条件、凝胶配方和批次、泳道图、上样质量与体积、运行模式和电流时间、标准品、转膜夹层方向、膜材质孔径、转移参数、总蛋白胶与整膜图、封闭和洗涤条件、抗体供应商／货号／批次／克隆或序列／宿主／稀释度、检测底物、成像设备、曝光或扫描设置，以及从原图到数值的背景区域和计算步骤。

图示可裁切到关注区域，但源数据须保留完整、未裁切的胶或膜边缘、全部泳道、分子质量标准和不同曝光。非相邻泳道或不同膜的拼接必须清楚标线并说明来源，亮度和对比度调整须对整幅图一致且不抹去条带或背景。Nature 的 Western 数据规范要求提供未处理整膜、标记相对分子质量并报告抗体身份与稀释；这些要求保护的是证据上下文，不是排版形式。¹²

结果文字应区分观察与解释。例如，“抗体 X 在约 55 kDa 处产生一条处于线性范围的信号，敲除样品中消失”比“蛋白 X 表达”包含更多可核查证据；若只见到预期位置条带而无独立验证，则应写成“与蛋白 X 一致的免疫反应性条带”。原始文件、曝光序列、泳道映射和排除决定进入原始数据与处理谱系，不能只保留论文式裁图。

参考资料与延伸阅读¶

• Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680–685.
• Reynolds JA, Tanford C. Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. PNAS. 1970;66:1002–1007.
• Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. PNAS. 1979;76:4350–4354.
• O'Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 1975;250:4007–4021.
• Uhlen M, Bandrowski A, Carr S, et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 2016;13:823–827.
• Taylor SC, Rosselli-Murai LK, Crobeddu B, Plante I. A critical path to producing high quality, reproducible data from quantitative western blot experiments. Scientific Reports. 2022;12:17599.
• Eaton SL, Roche SL, Llavero Hurtado M, et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLOS ONE. 2013;8:e72457.
• Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971;8:871–874.
• Thermo Fisher Scientific. Western blotting handbook and troubleshooting guide.
• Nature Portfolio. Western blot data acquisition and presentation guidelines.