分子克隆与构建设计¶

分子克隆把目标核酸装入能够在宿主中维持、筛选或表达的载体，再从候选细胞中确认构建的序列与结构。载体图谱、片段末端、组装化学、宿主递送和选择筛选组成一条连续的物料链；菌落、颜色或报告信号用于缩小候选范围，连接点、全长序列和功能仍需分别验证。

分子克隆从载体结构和 DNA 组装进入转化、筛选、文库、表达构建、条件遗传和定点／随机构建。插入片段的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）制备见核酸扩增与定量，内源染色体的定向改变见基因组编辑与验证，核酸杂交筛库见核酸杂交、探针与分子互作检测。重组／合成核酸和病毒载体的风险评估与机构审查见基因组编辑与验证及实验安全、伦理与风险管理。

载体结构与经典载体谱系¶

克隆载体至少需要在宿主中维持的复制或整合机制、选择标记以及接纳插入片段的区域。表达载体还需与宿主相容的启动子、转录终止信号、翻译起始环境、阅读框和常见的纯化／检测标签；穿梭载体为两种宿主分别提供维持与选择元件。质粒是可在适合宿主内复制或维持的遗传元件，其拷贝数和稳定性由复制子、宿主和培养选择共同决定，在不同实验状态下可呈共价闭合超螺旋、开环或线性等构象。

所谓“容量”通常是经验范围而非固定边界：插入片段的重复性、GC、毒性和宿主重组能力都能让较小构建也不稳定。完整的载体图谱应写明序列版本、复制起点、抗性基因、筛选元件、启动子方向和所有连接点，载体商品名仅作为产品身份信息。

限制酶、连接与 DNA 组装¶

限制性内切酶识别特定序列并切割 DNA。实验室最常用的 II 型限制酶通常以 Mg\(^{2+}\) 为催化辅因子，在识别位点内或附近切割，并不像 I 型限制—修饰复合物那样普遍依赖 ATP 完成远距离切割。不同酶可产生 5′ 突出端、3′ 突出端或平端；同裂酶识别相同序列，相容末端则可能来自识别序列不同的酶。相容只表示末端能够连接，连接后是否恢复某个识别位点仍要逐序列判断。

DNA 连接酶（DNA ligase）催化相邻 3′-OH 与 5′-磷酸之间形成磷酸二酯键。双酶切可用不相容末端规定插入方向并降低空载体背景；平端连接不依赖突出端配对，但有效碰撞少且无天然方向性；TA 克隆利用 Taq 产物的单 A 突出端与载体 T 突出端。载体去磷酸化可降低自身环化，同时也会改变连接产物对插入片段 5′-磷酸的要求。多核苷酸激酶可补加 5′-磷酸，聚合酶或核酸酶可修整末端，任何处理都应与后续连接化学相容。

一套教学方案把 5 µL 质粒与缓冲液、水和限制酶在 37 ℃反应 15 min，并要求酶液体积低于总体积的 10%。控制酶储存液带入的甘油和盐仍是有用考虑，但 DNA 量、酶活单位、缓冲液、反应温度、时间、甲基化敏感性和失活方式都取决于具体酶。双酶切前应查兼容缓冲条件，必要时顺序消化或在中间纯化；37 ℃和 15 min 只是特定酶和体系的反应条件。

现代无缝组装重新安排了末端产生与连接方式。Gibson 组装（Gibson assembly）在同一等温体系中由外切酶产生互补单链区、聚合酶填补缺口、连接酶封闭切口，可按设计的同源重叠区拼接多个片段。¹ Golden Gate 组装（Golden Gate assembly）利用 IIS 型限制酶在识别位点外切割，由自定义突出端规定片段顺序，并在同管切割—连接循环中把模块两端的识别位点排除在最终构建之外，适合模块化多片段组装；模块内部若有同一种酶的识别位点，通常须先改写或改用其他酶。² 重组克隆和其他非连接酶依赖（ligation-independent）的方法也能避开传统末端限制。方法选择取决于片段数、序列重复、是否允许接头痕迹、内部位点、成本和验证负担，新旧方法均需落实到具体构建设计。

转入宿主、选择筛选与克隆确认¶

细菌的化学感受态转化（transformation）常以二价离子、低温处理和短暂热激帮助质粒进入细胞；电转化用瞬时电场形成可逆膜通透，适合多种细胞与较低 DNA 输入，但对盐和电弧敏感。真核细胞中把核酸或核酸—蛋白复合物送入细胞通常称为转染（transfection），可采用脂质、聚合物、磷酸钙、电穿孔或其他递送体系；病毒介导的递送称为转导（transduction）。这些术语描述不同的生物学与递送情境，实际效率由细胞和体系共同决定。

选择条件使获得载体的细胞得以存活，筛选则在存活群体中区分候选结构。抗生素抗性和营养缺陷互补属于选择；蓝白斑是利用 lacZ α 互补（α-complementation）的筛选：在合适宿主、IPTG 和 X-Gal 条件下，空载体的完整 α 片段常形成蓝色菌落，插入打断 α 片段时常呈白色。载体缺失、宿主状态或显色不足也可产生白色菌落，未打断阅读框的插入也可呈浅蓝或蓝色，因此还需分子确认候选结构。

挑取候选后先保存与主平板坐标对应的单菌落，再用 colony PCR、质粒酶切或连接点测序初筛。最终构建应覆盖两端连接点、插入方向和全长序列；长片段、重复序列和功能构建还要检查载体骨架、拷贝数或结构图谱。来自单个 PCR 产物的多个菌落可能共享同一个早期聚合酶错误，独立克隆最好来自独立扩增或由高保真扩增与最终测序共同控制。

基因组、cDNA 与测序文库¶

基因组文库保存某一基因组样品的片段集合，理论上同时包含编码区、内含子、重复序列和调控区；cDNA 文库由 RNA 经逆转录获得，反映取样组织、时期、处理条件和 RNA 类型下能够进入逆转录与克隆流程的转录本。cDNA 文库便于在不能剪接真核内含子的细菌中表达开放阅读框，却不含基因组内含子和大多数远端调控序列，并受 RNA 丰度、完整性、引发方式和逆转录效率影响。

若目标片段占单个克隆的理论比例为 \(f\)，每个克隆独立且等概率抽样，希望至少一次包含目标的概率为 \(p\)，所需克隆数可估为

这个公式揭示文库规模与稀有片段的关系，却没有消除非随机剪切、克隆毒性、片段长度选择、重复序列不稳定和扩增偏倚。所谓“几倍基因组覆盖”也只有在插入分布近似随机、克隆独立且有效插入率已知时才有明确概率含义。经典基因组文库可通过菌落或噬菌斑杂交寻找克隆，再以重叠片段进行染色体步移和物理图谱；定位克隆则先用遗传标记逐步缩小区段，再把标记、物理克隆和候选基因验证接起来。现代测序拓展了序列发现的广度，经典文库仍适合保存长单倍型、复杂区域和功能构建。

在完整基因组和转录组易得之前，未知基因还可从已知蛋白序列反推简并引物／探针，以跨物种同源序列筛库，以插入标签和侧翼扩增定位基因，或用外显子捕获法从基因组克隆中寻找可被剪接识别的外显子。减法杂交和差异显示技术比较两个 RNA 群体以寻找差异片段，得到的是候选表达差异而非完整基因和因果机制。这些经典方法把蛋白、表型、物理克隆和表达证据接成可追踪的发现路径；当前数据库搜索和高通量测序提高了广度，候选仍须回到独立扩增、全长转录本和功能验证。

测序文库把片段连接到平台接头，并常加入样本索引、分子条形码或唯一分子标识符（unique molecular identifier，UMI）。样本索引用于混合测序后的样本拆分，UMI 尝试标记原始分子以识别后续 PCR 重复，两者承担的层级不同。片段化、末端修复、大小选择、接头连接、逆转录和 PCR 都会改变序列与长度代表性；低输入样品尤其容易由少数分子过度扩增形成高重复率。3C 家族先把空间邻近变成嵌合连接片段，ATAC 以 Tn5 同时切割和加接头，ChIP／CLIP 则先富集特定复合物再完成接头与扩增；这些特异的捕获化学见核酸杂交、探针与分子互作检测，共同的接头、扩增和复杂度问题仍遵循同一建库质量链。文库浓度、片段谱、接头二聚体、有效插入率和复杂度应与最终读段质控一起解释；总质量、可测序分子的摩尔浓度与组成分别提供不同层面的质量信息。

表达构建与条件遗传系统¶

表达构建需要把启动子、5′ UTR、翻译起始环境、开放阅读框、标签和终止／poly(A) 信号放在正确方向与阅读框内。大肠杆菌便于快速扩增和表达，却缺少剪接体以及许多真核糖基化、折叠和加工条件；酵母、昆虫、哺乳动物和植物系统提供不同的修饰、分泌与细胞环境。宿主选择应由蛋白用途、复合物、毒性、定位和质量属性决定。细菌包涵体是没有膜包围的高密度蛋白聚集物；从包涵体溶解并复性得到的蛋白仍须检验结构与活性。

GAL4／上游激活序列系统（upstream activating sequence，UAS）把空间控制与响应构建分开：驱动（driver）品系在特定调控元件下表达 GAL4，响应（responder）品系把 UAS、最小启动子和目标基因组合在一起，二者后代在 GAL4 出现的细胞中激活目标。UAS 构建以最小启动子承接转录，表达强度还受 UAS 数量、插入位点、温度和遗传背景影响。Brand 与 Perrimon 建立的果蝇二元表达路径使组织特异的异位表达成为经典遗传工具。³

FLP/FRT 与 Cre/lox 是位点特异重组系统。两个同向靶位点间的序列可被删除，反向位点可导致倒位，位于不同分子或染色体位置的位点还可能产生交换；实际结果取决于位点方向、距离、重组酶表达和细胞谱系。FLP/FRT 在果蝇中形成镶嵌克隆，Cre/lox 广泛用于条件等位基因；它们保留了“在特定时间和组织改变基因”的经典实验逻辑。⁴ 重组阳性报告只能证明报告构建发生相应改变，目标等位基因仍应独立分型。发育表型、遗传镶嵌和谱系推断见从基因型到发育过程，重组化学见位点特异性重组。

稳定转基因动物的经典路线包括把构建导入受精卵／早期胚胎，或先改造胚胎干细胞再筛选并产生嵌合体；建立品系后还要用后代分离确认遗传传递、拷贝数和插入位点。植物常用农杆菌（Agrobacterium）的二元载体把 T-DNA 递送到植物细胞，也可用粒子轰击等物理方式后经选择与再生获得植株。物种、外植体、基因型和实验目的共同决定递送与再生路线，单子叶和双子叶植物中均有适用的农杆菌转化体系。胚胎操作、组织培养和再生会产生嵌合、体细胞变异与插入位点效应，至少需要独立转化事件和适当空载体／未转化对照。

从随机突变到定点构建¶

error-prone PCR 通过降低聚合准确性提高随机突变率，DNA shuffling 则把同源序列片段化后重组，以组合不同亲本的变异。二者用于定向进化时，突变库的规模、突变谱、无功能克隆比例和筛选能力共同限定能探索的序列空间。筛选到的表型可能由多个连锁突变产生，应回测单个突变和组合，并在原始骨架中重建。

寡核苷酸定点突变和 overlap-extension PCR 可引入已知替换、缺失或插入；IIS 型组装和合成 DNA 又把多位点组合扩展到模块层面。噬菌体展示把候选肽／蛋白与编码 DNA 连接在同一颗粒上，核糖体展示以停滞的 mRNA—核糖体—多肽复合物保持基因型—表型联系。展示富集反映当前呈递、结合、洗脱和扩增条件下的选择优势，仍要以独立表达的候选验证亲和、特异性和功能。

可复现记录应保存载体和插入片段的完整序列版本、所有连接点、宿主基因型、转化或递送方式、选择筛选条件以及候选克隆谱系。文库构建还需记录片段化、末端处理、接头与 index／UMI 结构、扩增循环和各阶段质量控制，使低复杂度、接头二聚体和克隆偏倚能够追溯到具体操作环节。

故障定位¶

参考资料与延伸阅读¶

• Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
• Cohen, S. N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70, 3240–3244 (1973).
• Gibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods 6, 343–345 (2009).