核酸扩增与定量¶

核酸扩增以成对引物或特定引发策略在体外选择性复制模板区段。反应化学、模板与引物设计、污染控制和产物确认决定一次扩增能否支持检出、分型或定量；预期大小条带、Cq 或阳性分区数分别只是读出，仍需结合对照、效率、抑制与身份验证解释。

核酸扩增从 PCR 化学与引物设计进入反应优化、RT-PCR、qPCR、数字 PCR 和经典派生 PCR。核酸样品制备与凝胶基础见核酸提取、质量与电泳，PCR 产物进入载体、文库或表达构建的后续工作见分子克隆与构建设计，染色体靶位点的改变和等位基因验证见基因组编辑与验证。测序数据和 qPCR 数据处理分别见测序技术与读段证据和qPCR 相对与绝对定量。

从实验问题到操作链¶

方法选择要从预期读出和后续用途倒推。检出目标、定量起始分子和为克隆或编辑验证制备扩增子，分别要求不同的模板处理、反应格式和身份确认；扩增产物进入后续工作流时，还要把聚合酶错误、等位基因偏倚和污染风险一并传递到下一步。

PCR 反应的化学与循环¶

PCR 反应包含模板、成对引物、耐热 DNA 聚合酶、四种 dNTP、含盐和缓冲组分的反应液以及常需精确控制的 Mg\(^{2+}\)。变性使双链模板分开，退火让引物 3′ 端与模板配对，延伸则由聚合酶从引物末端合成新链；三步循环使两个引物限定的区段获得近似指数扩增。耐热聚合酶使反应能够反复经历高温而不必逐轮补酶，是经典 PCR 走向自动化的关键。¹

Mg\(^{2+}\) 同时参与聚合酶催化、dNTP 配位和核酸结构稳定。浓度不足会降低产量，过高可能提高非特异延伸；模板中的 EDTA、盐、血红素、多糖、酚或乙醇残留也会改变有效离子条件或抑制酶。DMSO、甜菜碱和甘油可在某些高 GC 或结构复杂模板中改善反应，却会改变酶活性、退火和熔解行为，需在目标体系中以梯度验证。

聚合酶的选择取决于产物用途。Taq 类酶延伸快、历史资料丰富，缺少 3′→5′ 校对活性，常在产物 3′ 端添加一个突出 A，适合常规检测和 TA 克隆；具有校对活性的聚合酶或混合酶通常具有较高保真度，常产生平端，更适合长片段、表达构建和定点突变。实际保真度、过程性、可扩增长度、GC 容忍度和末端性质应按具体酶及缓冲体系确认，不能由“Taq”“Pfu”这类家族名称推定全部性能。

一套 25 µL 教学反应由 1 µL 模板、2.5 µL 10× 缓冲液、1 µL Taq DNA 聚合酶、正反引物各 1 µL、2 µL 脱氧核苷三磷酸（deoxynucleoside triphosphate，dNTP）和 16.5 µL 水组成。这一配方呈现了“先配共同组分、酶最后加入”的经典训练，但缺少模板浓度、引物和 dNTP 储液浓度、酶活单位以及 Mg\(^{2+}\) 信息，跨试剂盒使用时需要依据酶说明书补足终浓度。为同一批样品配制反应预混液时，可按反应数加入移液余量，混匀并短暂离心后再分装模板。

循环程序也没有跨模板通用的固定数值。初始变性取决于酶的热启动方式和模板复杂度；退火温度由两条引物在实际盐条件下的熔解行为决定；延伸温度和时间依赖聚合酶与扩增子长度。循环数过少可能低于检出限，过多则进入平台期，增加非特异产物、聚合酶错误和组分耗竭。旧式“95 ℃—固定退火温度—72 ℃、30–40 个循环”可作为理解三阶段循环的范式，实验程序仍应由产物、酶和验证结果共同确定。

引物与扩增子设计¶

引物设计从写明参考序列版本和目标异构体开始。两条引物的熔解温度应相近，3′ 端要与目标稳定、特异地配对，并避开显著的自身互补、引物间互补、低复杂度、常见变异和不希望扩增的旁系同源序列。长度、GC 比例和退火温度是相互关联的设计变量，不存在适用于所有模板的“18–25 nt、40%–60% GC、3′ 端必须是 G/C、统一 62 ℃”规则。Primer3 等工具可以按热力学和产物约束生成候选，引物仍须对目标物种的参考序列和实际样品背景进行特异性检查。²

用途会改变扩增子几何。常规终点 PCR 需要条带在所用凝胶中可分辨；qPCR 通常选择较短且扩增效率稳定的区段；RT-PCR 可让引物跨越外显子连接点，或把两条引物分置于不同外显子，以降低基因组 DNA 造成的假阳性，但基因结构、假基因和可变剪接会影响这一策略。克隆引物的 5′ 端可加限制位点、保护碱基、同源臂、标签或突变碱基；这些尾序列首轮并不与模板完全配对，计算退火条件时要区分模板配对区与附加区，并在最终构建中逐碱基核对阅读框和连接点。

每一批扩增至少安排无模板对照和已知阳性对照。样品经提取时，提取空白可追踪提取过程污染；RNA 实验设置 no-RT 对照可发现基因组 DNA；容易受抑制的基质可加入独立的内扩增对照。阴性对照出现产物时，样品阴阳性已经不可解释；阳性对照失败时，样品无带只能称为该批反应无效。有关对照、批次和记录的共同原则见实验设计、记录与数据质量。

扩增控制、优化与产物确认¶

前 PCR 区、模板加入区和扩增后产物区应尽量单向分离，移液器、耗材和防护用品分区使用。扩增后的管含有极高拷贝数产物，是下一批假阳性的主要来源；滤芯吸头、封闭反应板、频繁更换手套和定期环境监测比事后反复调退火温度更能控制携带污染。适用时可采用 dUTP—UNG 体系降解既往含 dU 的扩增产物，但它不清除天然 DNA、同批新污染或不含 dU 的旧产物。

优化宜从可解释的小矩阵开始，分别改变退火温度、Mg\(^{2+}\)、引物浓度、模板输入或添加剂，避免一次同时改变多个因素。无带时先检查模板完整性和抑制、引物序列与方向、循环仪温度、酶和阳性对照；多带时检查引物特异性、退火窗口、模板量和热启动；拖尾可来自过量模板、盐、降解、循环过多或复杂产物。把唯一可见条带切胶回收并不能自动证明特异性，因为同长度非目标产物仍可共迁移。

产物大小只验证了一个物理维度。用于分型、克隆、突变或编辑判定的关键扩增子应通过限制图谱、探针、熔解曲线或测序获得第二种证据；表达构建通常需要覆盖完整插入片段和两端连接点。PCR 本身会引入碱基替换、嵌合体和等位基因偏倚，低频突变尤其要用独立扩增、分子标签或适当的误差模型排除聚合酶与测序噪声。

RT-PCR、qPCR 与数字 PCR¶

逆转录先把 RNA 转成互补 DNA（complementary DNA，cDNA）。oligo(dT) 以 poly(A) 尾起始，偏向成熟多腺苷酸化 RNA，并可能在降解样品中形成 3′ 偏倚；随机引物覆盖较广，也会复制 rRNA 和其他非目标 RNA；基因特异引物选择性高，却限制同一 cDNA 的后续用途。一步法把逆转录和 PCR 放在同一管内，减少转移和污染接口；两步法先制备 cDNA，再分配给多个靶标，便于共享样品但增加冻融、移液和批次来源。固定 10 µL 配方和“15 min 逆转录、5 s 终止”等条件对应特定酶体系，其他逆转录酶应采用各自验证过的反应条件。

实时定量 PCR 在每一循环读取荧光。DNA 结合染料能报告所有双链产物，需要熔解曲线和电泳等证据排除引物二聚体与非特异产物；水解探针以靶序列上第二个杂交事件提高辨别力，也仍受探针错配、降解和扩增效率影响。Cq 是荧光跨过所设阈值时的循环位置，不是样品中“基因表达量”的直接单位。相对定量要求目标和参考测定具有经验证的效率，并使用在样品条件下稳定的参考基因；GAPDH、ACTB 等常用基因不能未经验证便视为恒定。MIQE 指南把样品处理、引物序列、效率、对照、阈值和原始数据报告纳入同一质量链。³

绝对 qPCR 依赖可溯源标准品、标准浓度赋值和覆盖样品范围的标准曲线。若每循环效率为 \(E\)，理想扩增可写作 \(N_n=N_0(1+E)^n\)；真实反应中的效率会随抑制、产物积累和试剂耗竭改变。数字 PCR 把样品分成大量微小反应，以阳性分区比例和泊松模型反推靶分子浓度，减少对外部校准曲线的依赖。分区体积、阈值、分子聚集、限制性消化、雨滴区和逆转录效率仍会带来不确定度，因此 dPCR 也需要完整的样品、分区和分析记录。⁴

派生 PCR 的实验几何¶

多种经典 PCR 变体通过重新安排引物与循环关系，分别处理模板未知区域、低丰度靶标、空间位置或多个目标。

可复现记录应写明模板与参考序列版本、全部引物序列、聚合酶与试剂批号、反应终浓度和循环程序，并保存阳性、阴性与提取过程对照。qPCR 还需保留原始扩增与熔解曲线、阈值设定、效率估计、参考基因验证及排除规则；这些记录使后续复核能够区分真实低丰度、反应抑制、阈值选择和污染。

故障定位¶

参考资料与延伸阅读¶

• Saiki, R. K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487–491 (1988).
• Bustin, S. A. et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry 55, 611–622 (2009).